蚂蟥抗凝血的活性成分研究
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摘要
蚂蟥为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)的干燥全体,俗称宽体金钱蛭,是传统的活血化瘀药,具有破血通经,逐瘀消癥之效,为中国药典(2000版)收载的水蛭的三个品种之一。现代诸多的药理实验表明,蚂蟥具有抗凝血、抗血栓、抗血小板聚集等药理活性。为了进一步的探讨其药理作用的物质基础,本实验对蚂蟥抗凝血的活性成分进行了较为深入的研究。
为了避免炮制品对蚂蟥化学成分产生的影响,本实验的化学成分研究采用蚂蟥的鲜品,即秋季捕捉、采集后,置-20℃保存后备用。
首先,以凝血时间为指标,优选了蚂蟥的提取溶媒,即分别考察了用蒸馏水提取、生理盐水提取、不同浓度乙醇提取(30%,50%,75%,95%)、正丁醇提取、正己烷提取、磷酸盐缓冲液提取的提取液对家兔全血凝固时间的影响,而最终选择了用生理盐水提取。以蛋白质的含量和抗凝效价为指标,通过正交设计优选了总蛋白的最佳提取工艺,即采用生理盐水提取二次,第一次5倍量,第二次3倍量,每次冷浸2小时的工艺方法。采用盐析法进行初步的纯化,并分别采用CM-Sepharose、DEAE-Sephadex A-50、Sephacryl S-200HR、Sepharose F.F等凝胶层析方法和制备电泳等手段分离纯化了蚂蟥抗凝血的活性成分,共得到了10个组分,经检测有9个是蛋白质,其中有三个(MH-3、MH-6、MH-7)能延长家兔全血的凝血时间及其血浆复钙时间,而MH-3和MH-6的作用较显著。药理实验表明,MH-3和MH-6均能明显的延长小鼠断尾出血时间及以毛细玻管法测定的小鼠凝血时间,表明具有较强的抗凝血作用。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定了其中MH-3、MH-4、MH-5、MH-6、MH-7、MH-8、MH-9、MH-10的分子量,分别为15580Da、16960Da、20230Da、22020Da、24420Da、31880Da、33770Da、46440Da;并尝试用质谱法(Mass-spectrometry)测定了MH-2的分子量约为12042Da:用氨基酸自动分析仪分析了MH-3、MH-6、MH-7的氨基酸组成。
对比了蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)和水蛭(Hirude nipponica Whitman)的干品药材的抗凝血活性、氨基酸组成和二者蛋白质的电泳指纹图谱。对蚂蟥的干品药材进行了指纹图谱的质量标准研究和脂肪酸的组成分析。对蚂蟥鲜品的提取物进行了质量标准研究。
The Whitmania pigra Whitman is dry body of Hirudinidea animals.It is Chinese traditional medicine for removing blood stasis in Chinese pharmacopoeia. Pharmacology experimentation indicate: the Whitmania pigra Whitman has much pharmacological activity, such as antithrombotic, anticoagulant, antiplatelet and so on. This experimentation investigate mainly the chemical compsition of anticoagulant in whitmania pigra Whitman for knowing the substance foundation of pharmacological effect.This experimentation use flash animal of whitmania pigra Whitman to study the component for avoiding the effect of preparation.Firstly , regarding clotting time as index to select the extracting solution, viz reviewing respectively the effect of rabbit clotting time of distilled water extract, N. S extract, ethanol extract (30%, 50%, 75%, 95%) , n-butanol extract, n-hexane extract, PBS extract, then select the N. S extract, secondly, regarding content of protein and anticoagulant value as index to select the extracting technics by orthgonal experimental design, which is extract two times by N. S, first is 5 times , second is 3 times, and soaking 2h each times (4°C) . Adopting salting out to purify simplely the extraction. Thirdly, adopting respectively CM-Sepharose , DEAE-Sephadex A-50、 Sephacryl S-200HR、 Sepharose F. F and preparative electrophoresis to purify further it, lastly obtaining 10 compound, certaining 9 is protein, furthermore 3 from 9 (MH-3, MH-6, MH-7) can elongate the clotting time and resume calcium time of blood plasma of rabbit, the effect of MH-6 and MH-3 are stronger than MH-7. The pharmacology experimentation indicate: MH-6 and MH-3 can elongate evidencely the bleeding time of sniping tail of mice and the clotting time by glass capillany method, which can make sure that MH-6 and MH-3 have antithrombin activity. Determining the molecular weight of 8 protein by SDS-PAGE, which are 15580、 16960、 20230、22020、24420、31880、33770、46440, and determining the molecular weight of MH-2 by Mass-spectrometry, the molecular weight is 12043. Analyzing the constitute of amino acid in MH-3、 MH-6 and MH-7 by amino acidic analysis antomatist.Comparing the whitmania pigra Whitman with Hirudo nipponica in
antithrombin activity, in the constitute of amino acid and in fingerprintings of electrophoresis. Investigating the constitute of fatty acid in whitmania pigra Whitman and the fingerprintings of electrophoresi. Studying the quality standard of the whitmania pigra Whitman extraction.
为了避免炮制品对蚂蟥化学成分产生的影响,本实验的化学成分研究采用蚂蟥的鲜品,即秋季捕捉、采集后,置-20℃保存后备用。
首先,以凝血时间为指标,优选了蚂蟥的提取溶媒,即分别考察了用蒸馏水提取、生理盐水提取、不同浓度乙醇提取(30%,50%,75%,95%)、正丁醇提取、正己烷提取、磷酸盐缓冲液提取的提取液对家兔全血凝固时间的影响,而最终选择了用生理盐水提取。以蛋白质的含量和抗凝效价为指标,通过正交设计优选了总蛋白的最佳提取工艺,即采用生理盐水提取二次,第一次5倍量,第二次3倍量,每次冷浸2小时的工艺方法。采用盐析法进行初步的纯化,并分别采用CM-Sepharose、DEAE-Sephadex A-50、Sephacryl S-200HR、Sepharose F.F等凝胶层析方法和制备电泳等手段分离纯化了蚂蟥抗凝血的活性成分,共得到了10个组分,经检测有9个是蛋白质,其中有三个(MH-3、MH-6、MH-7)能延长家兔全血的凝血时间及其血浆复钙时间,而MH-3和MH-6的作用较显著。药理实验表明,MH-3和MH-6均能明显的延长小鼠断尾出血时间及以毛细玻管法测定的小鼠凝血时间,表明具有较强的抗凝血作用。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定了其中MH-3、MH-4、MH-5、MH-6、MH-7、MH-8、MH-9、MH-10的分子量,分别为15580Da、16960Da、20230Da、22020Da、24420Da、31880Da、33770Da、46440Da;并尝试用质谱法(Mass-spectrometry)测定了MH-2的分子量约为12042Da:用氨基酸自动分析仪分析了MH-3、MH-6、MH-7的氨基酸组成。
对比了蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)和水蛭(Hirude nipponica Whitman)的干品药材的抗凝血活性、氨基酸组成和二者蛋白质的电泳指纹图谱。对蚂蟥的干品药材进行了指纹图谱的质量标准研究和脂肪酸的组成分析。对蚂蟥鲜品的提取物进行了质量标准研究。
The Whitmania pigra Whitman is dry body of Hirudinidea animals.It is Chinese traditional medicine for removing blood stasis in Chinese pharmacopoeia. Pharmacology experimentation indicate: the Whitmania pigra Whitman has much pharmacological activity, such as antithrombotic, anticoagulant, antiplatelet and so on. This experimentation investigate mainly the chemical compsition of anticoagulant in whitmania pigra Whitman for knowing the substance foundation of pharmacological effect.This experimentation use flash animal of whitmania pigra Whitman to study the component for avoiding the effect of preparation.Firstly , regarding clotting time as index to select the extracting solution, viz reviewing respectively the effect of rabbit clotting time of distilled water extract, N. S extract, ethanol extract (30%, 50%, 75%, 95%) , n-butanol extract, n-hexane extract, PBS extract, then select the N. S extract, secondly, regarding content of protein and anticoagulant value as index to select the extracting technics by orthgonal experimental design, which is extract two times by N. S, first is 5 times , second is 3 times, and soaking 2h each times (4°C) . Adopting salting out to purify simplely the extraction. Thirdly, adopting respectively CM-Sepharose , DEAE-Sephadex A-50、 Sephacryl S-200HR、 Sepharose F. F and preparative electrophoresis to purify further it, lastly obtaining 10 compound, certaining 9 is protein, furthermore 3 from 9 (MH-3, MH-6, MH-7) can elongate the clotting time and resume calcium time of blood plasma of rabbit, the effect of MH-6 and MH-3 are stronger than MH-7. The pharmacology experimentation indicate: MH-6 and MH-3 can elongate evidencely the bleeding time of sniping tail of mice and the clotting time by glass capillany method, which can make sure that MH-6 and MH-3 have antithrombin activity. Determining the molecular weight of 8 protein by SDS-PAGE, which are 15580、 16960、 20230、22020、24420、31880、33770、46440, and determining the molecular weight of MH-2 by Mass-spectrometry, the molecular weight is 12043. Analyzing the constitute of amino acid in MH-3、 MH-6 and MH-7 by amino acidic analysis antomatist.Comparing the whitmania pigra Whitman with Hirudo nipponica in
antithrombin activity, in the constitute of amino acid and in fingerprintings of electrophoresis. Investigating the constitute of fatty acid in whitmania pigra Whitman and the fingerprintings of electrophoresi. Studying the quality standard of the whitmania pigra Whitman extraction.
引文
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