月安煎干预经前期综合征组方优化和作用机制研究
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摘要
目的：
在前期研究基础上,基于生物效应和均匀设计法优化月安煎的制备工艺和组方结构；初步探讨月安煎的作用机理,为后续新药研制提供实验依据。
材料与方法：
1.制备PMS肝郁脾虚证大鼠模型：选取处于动情周期非接受期的大鼠,利用束缚法结合皮下注射苯甲酸雌二醇注射液方法制备PMS肝郁脾虚证大鼠模型。
2.月安煎提取物中丹酚酸B含量测定方法的建立：建立HPLC测定月安煎提取物中丹酚酸B含量的方法,以提取物丹酚酸B的含量作为评价月安煎提取工艺及优化组方的化学指标。
3.月安煎干预实验性经前期综合征制备方法研究：利用药效学指标和化学指标为评价方法,比较水提法、双提法和醇提法3种提取方法制备的月安煎供试样品产物,以优选出该小复方的最佳提取方法。
4.均匀设计法优化月安煎组方最佳配伍研究：基于均匀设计法对月安煎组方进行优化,参照2010版药典一部中5种药材的规定用量范围,并结合临床实际确定各药的剂量范围,将5种药材作为5个因素,设计11个水平,实验采用U11(115)均匀设计,以特异性药效学指标和丹酚酸B的提取率作为评价依据,优化月安煎处方的药物组合及剂量配比。
5.月安煎最佳组方的验证及其治疗PMS机理的研究：对月安煎组方结构优化获取的各项理论值进行比较验证,选定最佳结构和剂量配比关系；测定模型血清中E2、P、5-HT、 T、PRL含量、对大鼠子宫进行病理学检查及电镜观察子宫超微结构变化,探讨最终选定的月安煎干预实验性类PMS肝郁脾虚证的可能作用机制。
结果：
1.制备了PMS肝郁脾虚证大鼠模型。本研究利用阴道涂片镜检法确定正常未孕大鼠的动情周期,选取处于动情周期非接受期的大鼠。将大鼠束缚于特制矿泉水瓶内,每日3h,连续21d,造成大鼠肝郁脾虚证后,每日皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.05mL(50μg),连续7d,即可制备PMS肝郁脾虚证大鼠模型。所制备的模型与正常组大鼠相比,精神萎靡,对外界刺激不敏感；旷场实验的水平得分、垂直得分和总分均显著减少；血清中E2显著升高、P显著降低,E2/P显著升高。
2.建立了HPLC测定月安煎提取物中丹酚酸B含量的方法。对照品溶液的制备方法：精密称取丹酚酸B对照品7.2mmg,置于10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。供试品溶液的制备方法：取提取液适量,置于25mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。色谱条件：色谱柱：Synergi Polar-Rp80A (250×4.6mm,4μm)；流动相：甲醇-乙腈-水-甲酸(30：10：59：1)；流速：1.0mL.min-1;柱温；30℃；检测波长：286nm；进样量：5μL。外标一点法计算提取液中丹酚酸B含量。
3.与模型组相比,月安煎双提法工艺组大鼠旷场实验的水平得分和总分均明显增加。3种提取工艺产物均能显著增加模型大鼠P水平,降低E2/P,双提法产物还可显著降低模型大鼠E2水平。3种工艺提取液中丹酚酸B的含量分别为：水提法70.4mg.mL-1、双提法89.2mg.mL-1、醇提法82.8mg.mL-1、双提法提取的丹酚酸B含量高于其他两种提取方法。
4.将旷场实验得分与E2/P水平进行综合评分,经逐步回归分析,得到回归方程：Y=0.7492+0.0180*X1-0.0031*X5-0.0005*X1*:X1-0.0001*X4*X4-0.0001*X1*X3+0.0002*X1*X4+0.0001*X1*X5+0.0003*X2*X5+0.0001*X3*X4,复相关系数为RR=1.0000,S=0.0001,F=1977622.9881,查表：F0.01(9,1)=602,F>F0.01(9,1),P<0.01,检验通过,方程有显著意义。理论最大值：Ymax=1.2261,得出月安煎理论最佳药物组合及剂量配比为：香附(18.18g)、白术(40.00g)、丹参(10.91g)、石菖蒲(30.00g)。利用逐步线性回归方法分析不同方药配伍对丹参中丹酚酸B提取率的影响,得到回归方程为提取率(%)=香附(g)×0.085一白术(g)×0.206+丹参(g)×0.01+石菖蒲(g)×0.068。由回归结果可见：丹参中丹酚酸B的提取率与菟丝子无关。两种评价结果显示均与菟丝子无关,提示药材菟丝子可以去除,在原方基础上精简了一味药材。
5.经药效学验证,与模型组相比月安煎优化方(后简称新月安煎)低(4.5g生药/kg)、中(9.0g生药/kg)、高(18.0g生药/kg)剂量组,旷场实验的水平得分和总分均显著增加(P<0.05),且量效关系明显,高剂量组垂直得分显著性增加(P<0.05)；新月安煎中、高剂量组P明显升高(P<0.01),E2/P明显降低(P<0.05)。新月安煎中、高剂量组5-HT含量明显升高(P<0.05),各给药组T含量虽有所增加,但无显著性差异(P>0.05)。高倍电镜观察大鼠子宫超微结构变化显示,新月安煎低、中、高剂量组对模型大鼠的线粒体、粗面内质网、细胞表面微绒毛损伤有明显的保护作用(P<0.01),提示本品可使细胞膜处于功能活跃状态,从而对经前期综合征的症状有所改善。病理学检查,确定各组大鼠子宫在腺体增生程度、腺上皮分泌情况及间质炎细胞浸润等方面的镜下表现无明显区别。
结论：
1.综合药效学和化学实验结果,并考虑减少醇溶剂的使用与残留,确定双提法为月安煎的最佳提取工艺。
2.采用均匀设计法设计实验,经多元回归分析,得出月安煎理论最佳剂量配比为香附：白术：菟丝子：丹参：石菖蒲=18.18：40.00：0.00：10.91：30.00。
3.优化的月安煎组方在原方基础上精简了一味药材。经药效学验证,可明显改善PMS肝郁脾虚症状,调节雌孕激素分泌紊乱状态,组方更加合理,剂量配比更加科学。
4.月安煎干预PMS肝郁脾虚证的可能作用机制为增加孕激素水平,降低E2/P,调整雌孕激素比例失衡状态。同时,可增加5-HT的合成,从而减轻或消除经前期综合征的精神症状。
Purpose:
In this research, the composing and dosage of the prescription were optimized based on pharmacology and uniform design. Yueanjian's mechanism of treating premenstrual syndrome was also studied.
Material and method:
1. The animal models of PMS with the syndrome of liver-depression and spleen-deficiency were established by chronic restraint stress.
2. The content of Salvianolic acid B in Yueanjian was determined by HPLC.
3. Yueanjian was extracted by three methods:water-extraction, steam-distillation and alcohol-extraction. Behavioral performances and the contents of estradiol and progestin in serum were analyzed after the animal models were treated with these three extracts. The contents of Salvianolic acid B in these three extracts were detected by HPLC. All these four indicators were used to optimize the extraction method of Yueanjian.
4. According to U11(115) uniform design table, five drugs in Yueanjian were treated as five factors, which were divided into11levels. Behavioral performances and the contents of estradiol and progestin in serum were used to optimize the prescription of Yueanjian.
5. The theoretical result was tested and verified by animal models of PMS. The levels of E2, P,5-HT, T and PRL in animal models'serum after treated with Yueanjian were analyzed. The ultrastructure and pathology of uterus were also checked to discuss Yueanjian's mechanism of treating premenstrual syndrome.
Results:
1. Vaginal smear cystourethroscopy were used to determine the estrogen cycle of unpregnant rates. Non-estrus rates were chosen and binded in special plastic bottles three times a day.21days later, Estradiol benzoate was hypodermically injected500μg per day, for7days. Compared with normal animals, model animals were listlessness. Model animals'scores in open field experiments were lower, and the levels of progestin declined significantly, while the levels of estradiol and E2/P increased appreciably.
2. The content of Salvianolic acid B in Yueanjian was determined by HPLC. The reference substance solutions preparation method:Precisely sampling the Salvianolic acid B7.2mg into10mL capacity bottle, ultrasonic dissolving in appropriate methanol, added methanol to scale, shook up. The sample preparation method:Taking some samples into25mL capacity bottle, added water to scale, shook up. Chromatographic condition: Synergi Polar-Rp80A (250×4.6mm,4μm) column. Mobile phase:methanol-acetonitrile-water-formic acid30:0:9:). Flow rate1.0mL·min-1.Column temperature:30℃. Detection wavelength:286nm.
3. The levels of progestin in animals treated with these three extracts were higher than model animals, while the levels of E2/P were lower. Steam distillations extract could also make the level of E2reduce significantly. The behavioral performances of animals treated by steam distillations were also higher than model animals. The content of Salvianolic acid B in the extract of steam-distillation was higher than other two extracts.
4. According to the result of multiple regression analysis of behavioral performances and levels of E2/P, the regression equation was:Y=0.7492+0.0180*X1-0.0031*X5-0.0005*X1*X1-0.0001*X4*X4-0.0001*X1*X3+0.0002*X1*X4+0.0001*X1*X5+0.0003*X2*X5+0.0001*X3*X4, multiple correlation coefficient was1.0000, the equation have prominent meanings. The best compatibility proportion of Yueanjian was rhizoma cyperi (18.18g), white atractylodes roots (40.00g), Salvia miltiorrhiza (10.91g) and rhizoma acori graminei (30.00g). According to the result of multiple regression analysis of extraction ratio of Salvia miltiorrhiza, the regression equation was:Y=0.085*X1-0.206*X2+0.01*X4+0.068*X5. These two result show that the seed of Chinese dodder could be removed.
5.The behavioral performances of animals treated by Yuananjian were higher than model animals. Yuananjian could also raise the level of progestin and reduce the level of E2/P. The content of5-HT in serum raised significantly after treated by Yuanjian. Yuanjian showed good protection to the damage of mitochondria, rough endoplasmic reticulum and microvilli on cell surface.
Conclusion:
1. On the basis of comprehensive analysis, steam-distillation was chosen as Yueanjian's best extraction method.
2. The best compatibility proportion of Yueanjian was rhizoma cyperi (18.18g), white atractylodes roots (40.00g),Salvia miltiorrhiza (10.91g) and rhizoma acori graminei (30.00g).
3. Yueanjian's mechanism of treating premenstrual syndrome maybe related with raising the level of progestin, reducing the level of E2/P and increasing the synthesis of5-HT.
在前期研究基础上,基于生物效应和均匀设计法优化月安煎的制备工艺和组方结构；初步探讨月安煎的作用机理,为后续新药研制提供实验依据。
材料与方法：
1.制备PMS肝郁脾虚证大鼠模型：选取处于动情周期非接受期的大鼠,利用束缚法结合皮下注射苯甲酸雌二醇注射液方法制备PMS肝郁脾虚证大鼠模型。
2.月安煎提取物中丹酚酸B含量测定方法的建立：建立HPLC测定月安煎提取物中丹酚酸B含量的方法,以提取物丹酚酸B的含量作为评价月安煎提取工艺及优化组方的化学指标。
3.月安煎干预实验性经前期综合征制备方法研究：利用药效学指标和化学指标为评价方法,比较水提法、双提法和醇提法3种提取方法制备的月安煎供试样品产物,以优选出该小复方的最佳提取方法。
4.均匀设计法优化月安煎组方最佳配伍研究：基于均匀设计法对月安煎组方进行优化,参照2010版药典一部中5种药材的规定用量范围,并结合临床实际确定各药的剂量范围,将5种药材作为5个因素,设计11个水平,实验采用U11(115)均匀设计,以特异性药效学指标和丹酚酸B的提取率作为评价依据,优化月安煎处方的药物组合及剂量配比。
5.月安煎最佳组方的验证及其治疗PMS机理的研究：对月安煎组方结构优化获取的各项理论值进行比较验证,选定最佳结构和剂量配比关系；测定模型血清中E2、P、5-HT、 T、PRL含量、对大鼠子宫进行病理学检查及电镜观察子宫超微结构变化,探讨最终选定的月安煎干预实验性类PMS肝郁脾虚证的可能作用机制。
结果：
1.制备了PMS肝郁脾虚证大鼠模型。本研究利用阴道涂片镜检法确定正常未孕大鼠的动情周期,选取处于动情周期非接受期的大鼠。将大鼠束缚于特制矿泉水瓶内,每日3h,连续21d,造成大鼠肝郁脾虚证后,每日皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.05mL(50μg),连续7d,即可制备PMS肝郁脾虚证大鼠模型。所制备的模型与正常组大鼠相比,精神萎靡,对外界刺激不敏感；旷场实验的水平得分、垂直得分和总分均显著减少；血清中E2显著升高、P显著降低,E2/P显著升高。
2.建立了HPLC测定月安煎提取物中丹酚酸B含量的方法。对照品溶液的制备方法：精密称取丹酚酸B对照品7.2mmg,置于10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。供试品溶液的制备方法：取提取液适量,置于25mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。色谱条件：色谱柱：Synergi Polar-Rp80A (250×4.6mm,4μm)；流动相：甲醇-乙腈-水-甲酸(30：10：59：1)；流速：1.0mL.min-1;柱温；30℃；检测波长：286nm；进样量：5μL。外标一点法计算提取液中丹酚酸B含量。
3.与模型组相比,月安煎双提法工艺组大鼠旷场实验的水平得分和总分均明显增加。3种提取工艺产物均能显著增加模型大鼠P水平,降低E2/P,双提法产物还可显著降低模型大鼠E2水平。3种工艺提取液中丹酚酸B的含量分别为：水提法70.4mg.mL-1、双提法89.2mg.mL-1、醇提法82.8mg.mL-1、双提法提取的丹酚酸B含量高于其他两种提取方法。
4.将旷场实验得分与E2/P水平进行综合评分,经逐步回归分析,得到回归方程：Y=0.7492+0.0180*X1-0.0031*X5-0.0005*X1*:X1-0.0001*X4*X4-0.0001*X1*X3+0.0002*X1*X4+0.0001*X1*X5+0.0003*X2*X5+0.0001*X3*X4,复相关系数为RR=1.0000,S=0.0001,F=1977622.9881,查表：F0.01(9,1)=602,F>F0.01(9,1),P<0.01,检验通过,方程有显著意义。理论最大值：Ymax=1.2261,得出月安煎理论最佳药物组合及剂量配比为：香附(18.18g)、白术(40.00g)、丹参(10.91g)、石菖蒲(30.00g)。利用逐步线性回归方法分析不同方药配伍对丹参中丹酚酸B提取率的影响,得到回归方程为提取率(%)=香附(g)×0.085一白术(g)×0.206+丹参(g)×0.01+石菖蒲(g)×0.068。由回归结果可见：丹参中丹酚酸B的提取率与菟丝子无关。两种评价结果显示均与菟丝子无关,提示药材菟丝子可以去除,在原方基础上精简了一味药材。
5.经药效学验证,与模型组相比月安煎优化方(后简称新月安煎)低(4.5g生药/kg)、中(9.0g生药/kg)、高(18.0g生药/kg)剂量组,旷场实验的水平得分和总分均显著增加(P<0.05),且量效关系明显,高剂量组垂直得分显著性增加(P<0.05)；新月安煎中、高剂量组P明显升高(P<0.01),E2/P明显降低(P<0.05)。新月安煎中、高剂量组5-HT含量明显升高(P<0.05),各给药组T含量虽有所增加,但无显著性差异(P>0.05)。高倍电镜观察大鼠子宫超微结构变化显示,新月安煎低、中、高剂量组对模型大鼠的线粒体、粗面内质网、细胞表面微绒毛损伤有明显的保护作用(P<0.01),提示本品可使细胞膜处于功能活跃状态,从而对经前期综合征的症状有所改善。病理学检查,确定各组大鼠子宫在腺体增生程度、腺上皮分泌情况及间质炎细胞浸润等方面的镜下表现无明显区别。
结论：
1.综合药效学和化学实验结果,并考虑减少醇溶剂的使用与残留,确定双提法为月安煎的最佳提取工艺。
2.采用均匀设计法设计实验,经多元回归分析,得出月安煎理论最佳剂量配比为香附：白术：菟丝子：丹参：石菖蒲=18.18：40.00：0.00：10.91：30.00。
3.优化的月安煎组方在原方基础上精简了一味药材。经药效学验证,可明显改善PMS肝郁脾虚症状,调节雌孕激素分泌紊乱状态,组方更加合理,剂量配比更加科学。
4.月安煎干预PMS肝郁脾虚证的可能作用机制为增加孕激素水平,降低E2/P,调整雌孕激素比例失衡状态。同时,可增加5-HT的合成,从而减轻或消除经前期综合征的精神症状。
Purpose:
In this research, the composing and dosage of the prescription were optimized based on pharmacology and uniform design. Yueanjian's mechanism of treating premenstrual syndrome was also studied.
Material and method:
1. The animal models of PMS with the syndrome of liver-depression and spleen-deficiency were established by chronic restraint stress.
2. The content of Salvianolic acid B in Yueanjian was determined by HPLC.
3. Yueanjian was extracted by three methods:water-extraction, steam-distillation and alcohol-extraction. Behavioral performances and the contents of estradiol and progestin in serum were analyzed after the animal models were treated with these three extracts. The contents of Salvianolic acid B in these three extracts were detected by HPLC. All these four indicators were used to optimize the extraction method of Yueanjian.
4. According to U11(115) uniform design table, five drugs in Yueanjian were treated as five factors, which were divided into11levels. Behavioral performances and the contents of estradiol and progestin in serum were used to optimize the prescription of Yueanjian.
5. The theoretical result was tested and verified by animal models of PMS. The levels of E2, P,5-HT, T and PRL in animal models'serum after treated with Yueanjian were analyzed. The ultrastructure and pathology of uterus were also checked to discuss Yueanjian's mechanism of treating premenstrual syndrome.
Results:
1. Vaginal smear cystourethroscopy were used to determine the estrogen cycle of unpregnant rates. Non-estrus rates were chosen and binded in special plastic bottles three times a day.21days later, Estradiol benzoate was hypodermically injected500μg per day, for7days. Compared with normal animals, model animals were listlessness. Model animals'scores in open field experiments were lower, and the levels of progestin declined significantly, while the levels of estradiol and E2/P increased appreciably.
2. The content of Salvianolic acid B in Yueanjian was determined by HPLC. The reference substance solutions preparation method:Precisely sampling the Salvianolic acid B7.2mg into10mL capacity bottle, ultrasonic dissolving in appropriate methanol, added methanol to scale, shook up. The sample preparation method:Taking some samples into25mL capacity bottle, added water to scale, shook up. Chromatographic condition: Synergi Polar-Rp80A (250×4.6mm,4μm) column. Mobile phase:methanol-acetonitrile-water-formic acid30:0:9:). Flow rate1.0mL·min-1.Column temperature:30℃. Detection wavelength:286nm.
3. The levels of progestin in animals treated with these three extracts were higher than model animals, while the levels of E2/P were lower. Steam distillations extract could also make the level of E2reduce significantly. The behavioral performances of animals treated by steam distillations were also higher than model animals. The content of Salvianolic acid B in the extract of steam-distillation was higher than other two extracts.
4. According to the result of multiple regression analysis of behavioral performances and levels of E2/P, the regression equation was:Y=0.7492+0.0180*X1-0.0031*X5-0.0005*X1*X1-0.0001*X4*X4-0.0001*X1*X3+0.0002*X1*X4+0.0001*X1*X5+0.0003*X2*X5+0.0001*X3*X4, multiple correlation coefficient was1.0000, the equation have prominent meanings. The best compatibility proportion of Yueanjian was rhizoma cyperi (18.18g), white atractylodes roots (40.00g), Salvia miltiorrhiza (10.91g) and rhizoma acori graminei (30.00g). According to the result of multiple regression analysis of extraction ratio of Salvia miltiorrhiza, the regression equation was:Y=0.085*X1-0.206*X2+0.01*X4+0.068*X5. These two result show that the seed of Chinese dodder could be removed.
5.The behavioral performances of animals treated by Yuananjian were higher than model animals. Yuananjian could also raise the level of progestin and reduce the level of E2/P. The content of5-HT in serum raised significantly after treated by Yuanjian. Yuanjian showed good protection to the damage of mitochondria, rough endoplasmic reticulum and microvilli on cell surface.
Conclusion:
1. On the basis of comprehensive analysis, steam-distillation was chosen as Yueanjian's best extraction method.
2. The best compatibility proportion of Yueanjian was rhizoma cyperi (18.18g), white atractylodes roots (40.00g),Salvia miltiorrhiza (10.91g) and rhizoma acori graminei (30.00g).
3. Yueanjian's mechanism of treating premenstrual syndrome maybe related with raising the level of progestin, reducing the level of E2/P and increasing the synthesis of5-HT.
引文
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