羊胎盘免疫调节因子免疫生物活性评价的初步研究
|
摘要
本课题以Mr10 000的羊胎盘免疫调节因子GPIF(goat plancenta immunoregulatory factor，GPIF)为免疫生物活性评价样品材料，对GPIF免疫生物活性进行了评价方法的比较筛选、免疫生物活性评价方法的优化，并在此基础上对GPIF进行了免疫生物活性评价，确立了GPIF免疫生物活性剂量效应曲线，探讨了不同工艺方法及处理因素对GPIF免疫生物活性的影响，与同类药品免疫生物活性进行了对比。
1、GPIF免疫生物活性评价实验样品材料的准备
通过对GPIF免疫生物活性评价实验样品材料的一般理化指标鉴定，光谱、指纹图谱检测和安全性评价，显示由该工艺制备的实验样品材料理化性质稳定，活性成分含量充足，安全可靠，可以用来作为GPIF免疫生物活性的评价。
2、GPIF免疫生物活性评价方法的比较筛选
初步比较筛选了两种形态学免疫生物活性评价方法，E玫瑰花环实验和淋巴细胞转化实验及两种光学比色免疫生物活性评价方法，淋巴细胞增殖实验MTT法和淋巴细胞增殖实验BrdU-ELISA法。并对初步筛选的E玫瑰花环实验和淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验进行了进一步筛选。最终确定GPIF免疫生物活性评价方法为：T细胞来源于胸腺的E玫瑰花环实验和PHA诱导的淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验。
3、GPIF免疫生物活性评价方法的优化
对GPIF E玫瑰花环实验在不影响SRBC活性的基础上用神经氨酸酶处理，经此法处理后E玫瑰花环形成率明显提高；对传统的ConA诱导的人外周血淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验，进行了方法学改进。采用PHA诱导的人外周血淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验效果远远优于ConA诱导增殖效果。
4、GPIF免疫生物活性的评价
理学硕d匕论文:羊胎丈免痰调节因子免痰生物翎亏性公卜价的初步研究
无论是E玫瑰花环实验，还是细胞增殖BrdU一ELISA实验，GPIF免疫生物活
性都呈现了稳定的剂量效应关系。表现为低浓度(0 .125mg/m1)免疫生物活性较
低，随着GPIF浓度升高而活性逐渐增强，到0.smg/m1浓度附近时免疫生物活性
达到最高，之后逐渐减弱。GPIF免疫生物活性剂量效应曲线呈正态分布。GPIF
是一种细胞免疫增强剂。
5、GPIF免疫生物活性影响因素的探讨
分别对GPIF病毒灭活、冻干工艺及赋形剂的选择、分子截留和制备工艺方
法等影响因素进行了对比分析。研究结果显示，病毒灭活、冻干工艺及赋形剂的
选择和分子截留对GPIF免疫生物活性没有任何影响，但因制备工艺方法的不同，
免疫生物活性也会有改变。免疫生物活性实验证实超滤法提取的GPIF免疫生物
活性优于透析法。
6、GPIF与同类药品免疫生物活性比较研究
我们在对比GPIF与所有重庆市制药企业生产的以及在重庆市销售的同类药
品胸腺肤注射液、胸腺肤肠溶片(胶囊)和转移因子注射液免疫生物活性时发现，
采用此标准制备的GP工F免疫生物活性高于同类产品免疫生物活性。
综上所述，通过对GPIF免疫生物活性评价实验样品材料的准备，显示由该
工艺制备的实验样品材料理化性质稳定，活性成分含量充足，安全可靠，可以用
来作为GPIF免疫生物活性的评价;通过对GPIF免疫生物活性评价方法的比较筛
选及评价方法的优化，为GPIF质量标准建立了较优免疫生物活性评价手段;同
时GPIF免疫生物活性剂量效应的发现，为该产品的免疫生物活性深入研究奠定
了基础，也为GPIF药效学研究提供了理论资料;对GPIF免疫生物活性影响因素
的探讨及与同类药品免疫生物活性的对比，证实GPIF是一种免疫生物活性稳定、
且具有高免疫生物活性的细胞免疫增强剂;同时，本研究也为同类产品免疫生物
活性评价提供了方法学参考。
In this paper, the preparation of goat plancenta immunoregulatory factor(GPIF) avivity samples, the comparison among several methods for evaluating immunobiologic activity and the choosing of optimum methods have been systematically studied. On the base of these, we have evaluated the immnobiologic acitivity of GPIF, finded the dose-effect activity curve of GPIF; and analyzed influencing factors of different grafts, disposal means on GPIF immunobiologic activity. Further, we compared GPIF immunobiologic activity with the similar drugs.
1.The preparation of GPIF avivity evaluation samples: By identifling the physiochemistry items, UV spectrum data, Chromatographic Fingerprints test and safty evaluation, we found GPIF activity evaluation samples were eligible.
2.The comparison of methods of immunobiologic activity evaluation: In this paper, we primitivily selected two kinds of morphologic methods to evaluate GPIF immunobiologic activity: E rosettes experiment, Lymphocyte transformation experiment, and two kinds of optic colorimetry immunobiologic activity evaluation methods: cell proliferation MTT assay, cell proliferation BrdU-ELISA assay. And further studied E rosettes experiment and lymphocyte proliferation BrdU-ELISA assay. Finally, we ensure immunobiologic activity evaluation methods of GPIF wre T cells from pigs thymus of E rosettes experiment and PHA inducing lymphocyte proliferation BrdU-ELISA assay.
3.The choosing of optimum evaluating methods of immunobiologic activity: If we disposed sheep blood red cells with neuraminic acid enzyme, the E rosettes forming ratio remarkbly increased; We improved the conventional method of BrdU-ELISA assay on lymphocyte proliferation induced by ConA. The results showed that lymphocyte proliferation induced by PHA was better than by ConA.
4. Immunobiologic activity evaluation of GPIF: Both E rosettes experiment and lymphocyte proliferation assasy showed that immunobiologic activity of GPIF steadily exited dose-effect relations, namely, the low concentration (0.125mg/ml) activity was lowwer, with the concentration increasing, immunobiologic activity of GPIF gradually increased, when it was at the 0.5mg/ml, immunobiologic activity of GPIF reached summit. After that, the immunobiologic activity gradually weakened. The immunobiologic activity of GPIF curve was normal school.
5.Analyse of influencing factors for immunobiologic activity of GPIF: The analyse results of influencing factors of high temperature diposaling virus, freezy-dry craft, choose of excipents, different Mr interception, preparation graft on GPIF indicated that high temperature diposaling virus, freezy-dry craft, choose of excipents, different Mr interception did not exited any influencing factors on GPIF. But, when preparation graft changed, the GPIF immunobiologic activity also changed with it. Activity evaluation assay proved that ultrafilter graft was better than dialysis.
6.The comparison of GPIF immunobiologic activity with the similar drugs. When we compared the immunobiologic activity of GPIF to thymopolypeptides solution, thymopolypeptides enteric-coated tablets and tansfer factor solution, the checking results indicated that immunobiologic activity of GPIF was higher than the similar drugs, which were produced and saled in Chongqing.
In conclusion, the results of checking of physiochemistry items, UV spectrum data, Chromatographic Fingerprints test and safty evaluation indicated that GPIF avivity evaluation samples were eligible. Through the comparison of methods for evaluating immunobiologic activity and the choosing of optimum methods to evaluating immunobiologic activity, we created assay methods evaluating immunobiologic activity for quality standard of GPIF.The research of dose-effect of GPIF can also supply theoretical materials for pharmacology. That the experiments on the factors which affect the immunobiologic activity of GPIF and the comparison with similar drugs demonstrated that GPIF was a kind of cellar immunoregulating drug with stable and high immunobiologic activity. At
1、GPIF免疫生物活性评价实验样品材料的准备
通过对GPIF免疫生物活性评价实验样品材料的一般理化指标鉴定，光谱、指纹图谱检测和安全性评价，显示由该工艺制备的实验样品材料理化性质稳定，活性成分含量充足，安全可靠，可以用来作为GPIF免疫生物活性的评价。
2、GPIF免疫生物活性评价方法的比较筛选
初步比较筛选了两种形态学免疫生物活性评价方法，E玫瑰花环实验和淋巴细胞转化实验及两种光学比色免疫生物活性评价方法，淋巴细胞增殖实验MTT法和淋巴细胞增殖实验BrdU-ELISA法。并对初步筛选的E玫瑰花环实验和淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验进行了进一步筛选。最终确定GPIF免疫生物活性评价方法为：T细胞来源于胸腺的E玫瑰花环实验和PHA诱导的淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验。
3、GPIF免疫生物活性评价方法的优化
对GPIF E玫瑰花环实验在不影响SRBC活性的基础上用神经氨酸酶处理，经此法处理后E玫瑰花环形成率明显提高；对传统的ConA诱导的人外周血淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验，进行了方法学改进。采用PHA诱导的人外周血淋巴细胞增殖BrdU-ELISA实验效果远远优于ConA诱导增殖效果。
4、GPIF免疫生物活性的评价
理学硕d匕论文:羊胎丈免痰调节因子免痰生物翎亏性公卜价的初步研究
无论是E玫瑰花环实验，还是细胞增殖BrdU一ELISA实验，GPIF免疫生物活
性都呈现了稳定的剂量效应关系。表现为低浓度(0 .125mg/m1)免疫生物活性较
低，随着GPIF浓度升高而活性逐渐增强，到0.smg/m1浓度附近时免疫生物活性
达到最高，之后逐渐减弱。GPIF免疫生物活性剂量效应曲线呈正态分布。GPIF
是一种细胞免疫增强剂。
5、GPIF免疫生物活性影响因素的探讨
分别对GPIF病毒灭活、冻干工艺及赋形剂的选择、分子截留和制备工艺方
法等影响因素进行了对比分析。研究结果显示，病毒灭活、冻干工艺及赋形剂的
选择和分子截留对GPIF免疫生物活性没有任何影响，但因制备工艺方法的不同，
免疫生物活性也会有改变。免疫生物活性实验证实超滤法提取的GPIF免疫生物
活性优于透析法。
6、GPIF与同类药品免疫生物活性比较研究
我们在对比GPIF与所有重庆市制药企业生产的以及在重庆市销售的同类药
品胸腺肤注射液、胸腺肤肠溶片(胶囊)和转移因子注射液免疫生物活性时发现，
采用此标准制备的GP工F免疫生物活性高于同类产品免疫生物活性。
综上所述，通过对GPIF免疫生物活性评价实验样品材料的准备，显示由该
工艺制备的实验样品材料理化性质稳定，活性成分含量充足，安全可靠，可以用
来作为GPIF免疫生物活性的评价;通过对GPIF免疫生物活性评价方法的比较筛
选及评价方法的优化，为GPIF质量标准建立了较优免疫生物活性评价手段;同
时GPIF免疫生物活性剂量效应的发现，为该产品的免疫生物活性深入研究奠定
了基础，也为GPIF药效学研究提供了理论资料;对GPIF免疫生物活性影响因素
的探讨及与同类药品免疫生物活性的对比，证实GPIF是一种免疫生物活性稳定、
且具有高免疫生物活性的细胞免疫增强剂;同时，本研究也为同类产品免疫生物
活性评价提供了方法学参考。
In this paper, the preparation of goat plancenta immunoregulatory factor(GPIF) avivity samples, the comparison among several methods for evaluating immunobiologic activity and the choosing of optimum methods have been systematically studied. On the base of these, we have evaluated the immnobiologic acitivity of GPIF, finded the dose-effect activity curve of GPIF; and analyzed influencing factors of different grafts, disposal means on GPIF immunobiologic activity. Further, we compared GPIF immunobiologic activity with the similar drugs.
1.The preparation of GPIF avivity evaluation samples: By identifling the physiochemistry items, UV spectrum data, Chromatographic Fingerprints test and safty evaluation, we found GPIF activity evaluation samples were eligible.
2.The comparison of methods of immunobiologic activity evaluation: In this paper, we primitivily selected two kinds of morphologic methods to evaluate GPIF immunobiologic activity: E rosettes experiment, Lymphocyte transformation experiment, and two kinds of optic colorimetry immunobiologic activity evaluation methods: cell proliferation MTT assay, cell proliferation BrdU-ELISA assay. And further studied E rosettes experiment and lymphocyte proliferation BrdU-ELISA assay. Finally, we ensure immunobiologic activity evaluation methods of GPIF wre T cells from pigs thymus of E rosettes experiment and PHA inducing lymphocyte proliferation BrdU-ELISA assay.
3.The choosing of optimum evaluating methods of immunobiologic activity: If we disposed sheep blood red cells with neuraminic acid enzyme, the E rosettes forming ratio remarkbly increased; We improved the conventional method of BrdU-ELISA assay on lymphocyte proliferation induced by ConA. The results showed that lymphocyte proliferation induced by PHA was better than by ConA.
4. Immunobiologic activity evaluation of GPIF: Both E rosettes experiment and lymphocyte proliferation assasy showed that immunobiologic activity of GPIF steadily exited dose-effect relations, namely, the low concentration (0.125mg/ml) activity was lowwer, with the concentration increasing, immunobiologic activity of GPIF gradually increased, when it was at the 0.5mg/ml, immunobiologic activity of GPIF reached summit. After that, the immunobiologic activity gradually weakened. The immunobiologic activity of GPIF curve was normal school.
5.Analyse of influencing factors for immunobiologic activity of GPIF: The analyse results of influencing factors of high temperature diposaling virus, freezy-dry craft, choose of excipents, different Mr interception, preparation graft on GPIF indicated that high temperature diposaling virus, freezy-dry craft, choose of excipents, different Mr interception did not exited any influencing factors on GPIF. But, when preparation graft changed, the GPIF immunobiologic activity also changed with it. Activity evaluation assay proved that ultrafilter graft was better than dialysis.
6.The comparison of GPIF immunobiologic activity with the similar drugs. When we compared the immunobiologic activity of GPIF to thymopolypeptides solution, thymopolypeptides enteric-coated tablets and tansfer factor solution, the checking results indicated that immunobiologic activity of GPIF was higher than the similar drugs, which were produced and saled in Chongqing.
In conclusion, the results of checking of physiochemistry items, UV spectrum data, Chromatographic Fingerprints test and safty evaluation indicated that GPIF avivity evaluation samples were eligible. Through the comparison of methods for evaluating immunobiologic activity and the choosing of optimum methods to evaluating immunobiologic activity, we created assay methods evaluating immunobiologic activity for quality standard of GPIF.The research of dose-effect of GPIF can also supply theoretical materials for pharmacology. That the experiments on the factors which affect the immunobiologic activity of GPIF and the comparison with similar drugs demonstrated that GPIF was a kind of cellar immunoregulating drug with stable and high immunobiologic activity. At
引文
1．葛瑞宏，纪芳，朱蓓薇．羊胎盘肽的研制[J]．大连轻工业学院学报．2003，22(4)：69-272．
2. Sin-ichi Togashi, Noriko Takahashi, Masanori Lwama, Satoshi Watanabe, Kayoko Tamagawa and Tetsuya Fukui. Antioxdative collagen-derived peptides in human-placenta extract[J].Placenta(2002), 23,497-502.
3．黄楚华，殷学伦．超滤法制备胎盘肽的初步研究[J]．中国生化药物杂志，1994，15(2)：133-134．
4．刘晓颖，葛宏华，耿亮等．牛脾转移因子的提取工艺研究[J]．生物学杂志，2000，17(1)：13-14．
5．戴申，孔艳，康泓等．药品申报审批实用手册[M]．北京：中国医药科技出版社，2000．
6．程夷．关于生物制品质量的回顾与展望[J]．微生物学免疫学进展，1994，22：39-42．
7．刘宇，高利臣，魏泓．羊胎提取液的实验研究[J]．中国生化药物杂志，2003，24(4)：170-172．
8．聂怀顺．羊胎素冻干粉及其生产方法[P]，中华人民共和国：98115761．0，1999年1月6日．
9. Lin YuanZao, Zhao Aiping, Chen Gengfu. Studies of Hepatitis B-virus Specific Transfer factor Preparation[J]. 药物生物技术，2000,7(3):141～145.
10．许代娣，李琪，何树生．胎盘免疫调节因子的制备[J]．广西医学，2001，23(4)：798-799．
11．杨秀芳，许牡丹，吴明鑫．活化羊胎素的提取和应用开发[J]．宝鸡文理学院学报(自然科学版)，1999，19(1)：40-41．
12．吴文惠．羊胎素提取工艺[P]，中华人民共和国：00105233．0，2000年11月15日．
13．西安阳光保健品开发有限责任公司．一种羊胎素针剂的制造方法[P]，中华人民共和国：98112918．8，2000年1月26日．
14．许代娣，李琪，何树生．胎盘免疫调节因子的制备[J]．广西医学，2001，23(4)：789-799．
15．国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．北京：化学工业出版社，2000．附录40-71．
16．尹幸念，解国梁，王莉等．羊胎盘粉的毒理学研究[J]．内蒙古医学杂志，1996，16(5)：265-266．
17．人胎盘组织液制造及检定规程[S]．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版暂行规程[M]．北京：化学工业出版社，2000，31—32
18．陆晖，闫晓梅，张双全．羊胎盘活细胞素微量元素和氨基酸组成的分析[J]．南京师大学报(自然科学版)，2001，24(1)：79-82．
19．郑健，陈焕文，刘宏伟等．紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用[J]．分析科学学报，2002，18(2)：158-163．
20．抗乙性肝炎胎盘转移因子注射液制造及检定规程[S]．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版2002增补本[M]．北京：化学工业出版社，2000，37-41．
21．抗乙性肝炎转移因子制造及检定规程[S]．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版暂行规程[M]．北京：化学工业出版社，2000，45—48．
22．刘刚，刘大涛．转移因子的性质研究[J]．吉林大学自然科学学报，2000，7(3)：104—106．
23．刘士山，张之周，朱和平等．羊胚胎盘肽功能测试[J]．中国生化药物杂志，2002，23(5)：236-238．
24．赖海昌，陈菁，赖文辉．猪脾转移因子多肽含量测定方法的改进[J]．广东药学院学报，1995，11(3)：188-189．
25．宋愿智，蔡晓民，崔玉绵．转移因子质量标准异同浅析[J]．西北药学杂志，2000，15(5)：219-220．
26．曾苏．生物药物分析方法的认证、质量控制及其标准操作规程[J]．中国医药工业杂志，1995，26(3)：136-139．
27．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版[M]．北京：化学工业出版社，2000，29—40．
28．中国药学会．药品注册管理办法(试行)高级培训班讲义[M]北京：国家药品监督管理局，2002．
29. Hagan-RL. High performance liquid chromatography for small-scale studies of drug stability[J]. Am-J-Hosp-Pharm, 1994,51(1):2162-2175.
30. Kalghatgi K, Horvath C. Rapid analysis of proteins and peptides by reversed-phase chromato- graphy[J]. J Chromatogr A, 1987, 398:335-339
31．忻余，徐康森．高效液相色谱法测定尿多酸肽注射液小分子肽的分子量[J]．药物分析杂志，2001，21(3)：191-193．
32. Lee-K-R, Bongers-J, Gulati-D et al. Statistical validation of reproducibility of HPLC peptide mapping for the identity of an investigational drug compound based on principal component analysis[J]. Drug-Dev-Ind-Pharm. 2000, 26(10): 1045-1057.
33．2000国药标字XG-042号．胸腺肽溶液质量标准[S]．
34．2001国药标字WS-227(X-202)号．注射用促肝细胞生长素[S]．
35．邓兆群，闵磊，曹晓春等．口服抗乙肝转移因子免疫免疫生物活性研究[J]．氨基酸和生物资源，2001，23(1)：24-25．
36．李星，李伟，秦瑛等．人早期胚胎免疫生物活性因子抗肿瘤作用初步研究[J]．现代预防医学，1997，24(4)：403-440．
37．高利臣，刘宇，魏泓．羊胎免疫调节因子免疫生物活性的研究[J]．中国生化药物杂志，2004，25(2)：72-74．
38．黄楚华．殷学伦．胎盘肽制剂的理化性质及免疫免疫生物活性研究[J]．药物生物技
术，1995，2(2)：40—42．
39．林军，董湘兰．陈宁等．人胎盘免疫调节因子稳定性试验[J]．中国生化药物杂志，1998，19(2)：101～102．
40．陈奇．中药药理研究方法学[M]．北京：人民卫生出版社，1993．747～750．
41．刘丹，刘永强．两种鹿茸多肽生物学免疫生物活性检测方法的比较[J]．中国生物制品学杂志，2003，16(1)：46-47．
42．孙清河，李帆．曲利本兰在E玫瑰花环实验中的应用[J]．新乡医学院学报，2001，18(2)：141．
43．陈妍柯，王亚鹏，吴建中．E花环测定胸腺肽活性的剂量效应[J]．中国生化药物杂志，2001，22(5)：245-246．
44．曹红翠，许文荣，单玉荣等．MTT比色法测定血小板免疫活性的实验研究[J]．镇医学院学报，1998，8(3)：295-296．
45．姜圣亮，朱上林，王天翔等．MTT法应用于肝癌化学免疫治疗敏感性研究[J]．肿瘤，2001，21(1)：23-25．
46. C.A. Russell, L.L. Vindelov. Optimization and comparison of the MTT assay for the detection of IL-2 in helper T cell precursor assays[J].Journal of immunololgic methds 217(1998):165-175.
47. Ute Wagner, Eberhard Burkharddt, Klaus Failing. Evaluation of canine lymphocyte proliferation: comparison of three different colorimetric methods with the ~3H-thymidine incorporation assay[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 70(1999):151-159.
48．唐莉莉，杨严俊，马培松等．酶联免疫吸附技术用于蛋黄中免疫球蛋白免疫生物活性的测定[J]．Acta Nutrimenta Sinica，1999，21(3)：318-321．
49．白岚，姜云飞，孔宪涛。多抗-单抗夹心ELISA检测可溶性白介素-2受体，上海医学检验杂志，1994，9(1)：15-16。
50．李金屏．胸腺肽及其制剂的研究概况[J]．氨基酸和生物资源，1999，21(4)：29-33．
51．徐叔云，卞如濂，陈修。药理实验方法学(第三版)[M]．北京：人民卫生出版社，2002：1423。
52．李玲，刘健，周践等．从历版中国药典分析方法的统计与研究看我国药物分析方法的发展[J]．药物分析杂志，1998，18(5)：349-352．
53．张为宇，黄维义，Chauvin Alain．两种方法测定羊外周血淋巴细胞增殖的研究[J]．中国兽医杂志．2003，39(6)：3-6．
54．王国华，程往太，马红燕等．胎盘提取物促淋巴细胞增殖免疫生物活性及稳定性实验初探[J]．中国生化药物杂志，2001，22(3)：137-139．
55. Scheibenbogen C., Romero P, Rivoltinni, Herr W, Schmittel A, Cerottini, woelfel T, Eggermont AM, Keilholz U. Quantitattin ofantigenreactive T ceUs in periphral blood by IFN_r—ELISAPLOT assay and chromium release assay: a four-centre comparative trial[J]. ImmunoL. Methods, 2000, 244: 81-89.
56．林克江，刘智华，尤启冬．α、β多肽抗菌免疫生物活性的定量构效关系研究[J]．药物生物技术．2003，10(5)：299-303
57．刘杨，何华，倪坤仪．生化药物分析方法的现状与进展[J]．药学进展，2001，25(2)：71-75．
58．石继红，张英起，赵宁等．胸腺素a1的生化特性及生物学免疫生物活性的分析[J]．药物分析杂志，2001，21(4)：237-240．
59．丰慧根，李延冬，任太芳等．胎盘免疫调节肽的抗肿瘤作用[J]．中国生化药物杂志，1998，19(2)：82～83．
60．宋燕爽，杨毅，李川．人胚胎提取液生物学免疫生物活性研究及临床应用展望[J]中国肿瘤临床，1996，23(2)：92-96．
61．董伟，宋旭华，王录焕等．生物免疫生物活性肽-Pm 对小鼠免疫功能影响的探讨[J]．中国免疫学杂志，1999，11(8)：355．
62．葛轶群，俞建瑛，宋聿文等．生物免疫生物活性肽研究进展[J] 中国生化药物杂志，1998，19(6)：404—406．．
63．石继红，张英起，赵宁等．胸腺素α_1的生化特性及生物学免疫生物活性的分析[J]．药物分析杂志，2001，21(4)：237-240．
64．陆德源．现代免疫学[M]．上海：上海科学技术出版社，1995．29～137．
65．龚非力，裘法祖，吴在德，武忠弼．基础免疫学[M]．湖北：湖北科学技术出版社，1998．12．
66．江腊梅．胸腺素注射液免疫免疫生物活性测定实验的探讨[J]．中国生化药物杂志,2000,21(3)：140-141．
67．朱立平，陈学清．免疫学常用实验方法[M]．北京：人民军医出版社，2000: 175-180．
68．郝文琳，孙超 多肽抗生素在免疫系统中的作用[J]．中国药理学通报．2003．19(1)：1-5．
69. Gallin J I, Kirkpatrick C H. Chemotactic Activity in Dialyzable Transfer Factor[J]. Proc Nat Acad Sci, USA, 1974,71: 498-502.
70．吴凌，王国良，孙斌等．人和动物胎盘药理作用和临床应用的研究进展[J]．黑龙江八一农垦大学学报，2001，13(2)：68-71．
71. A P Biotech. Cell proliferation ELISA system, version 2[Z]. USA, 1988: 29-31.
72. Petraglia F, Georgieva R, Stefanov D et al. Effects of the whole extract and the chromatographic fractions of the pig placenta on lymphocyte proliferation and humoral immune response[J].J Clin Endocrinol metab, 1994,78: 205-211.
73. Georgieva. R, Michailova. A, Rasher. P, et al. Effects of the chromatographic
fractions of the pig placenta trophoblast on graft-versus-post reaction[J]. Theriogenology, 2000,88:1706-1715.
74. Banerjee KK, Bishayee A, Chatterjee M. Effects of human placenta extract on brain monoamines and monoamine oxidase activity in rats[J]. Tohoku J Exp Med, 1995, 176(1):17-24.
75．秦鹏春．哺乳动物胚胎学[M]．北京：科学出版社，2001．
76. Togashi S, Takahashi N, Lwama M, et al. Antioxidative Collagen-Derived Peptides In Human-Placenta Extract[J].Placenta, 2002,23: 497-50.
77．王凤山，张天民，李栽连等．人胚胸腺提取物的亚组分及其免疫免疫生物活性[J]．山东医科大学学报，1992，30(2)：159-161．
78. Nunn JF. Ancient egyptian medicine. University of Oklahoma Press[J]. 1996: 148-151.
79. Slemmon,-J-R, Flood,-D-G. Profiling of endogenous brain peptides and small proteins:methodogy, computer-assisted ananlysis, and application to aging and lesion models Neurobiol-Aging. 1992,13(6):649-600.
80. K. U. Ansari, Nira Gupta, S.K. Bapat. An experimental and lcinical evaluation of immuno-modulating potential of human placental extractIndia Jornal of pharmachology, 1994,26:130-132.
81. Sur TK, Biswas Tuhin Kanti, ALI Liaquat, MUKHERJEE Biswapati. Anti-inflammatory and anti-platelet agregation activity of human placenta extract[J]. Acta Phaarmacol Sin, 2003,24(2):187-192.
82. Biswas Tuhin Kanti, AUDDY Biswajit, BHATTACHARYA Nitai P, BHATTACHARYA Sunahshree, MUKHERJEE Biswapati. Wound healing activity of human placental extracts in rats[J]. Acta Phaarmacol Sin, 2001, 22(12): 1113-1116.
2. Sin-ichi Togashi, Noriko Takahashi, Masanori Lwama, Satoshi Watanabe, Kayoko Tamagawa and Tetsuya Fukui. Antioxdative collagen-derived peptides in human-placenta extract[J].Placenta(2002), 23,497-502.
3．黄楚华，殷学伦．超滤法制备胎盘肽的初步研究[J]．中国生化药物杂志，1994，15(2)：133-134．
4．刘晓颖，葛宏华，耿亮等．牛脾转移因子的提取工艺研究[J]．生物学杂志，2000，17(1)：13-14．
5．戴申，孔艳，康泓等．药品申报审批实用手册[M]．北京：中国医药科技出版社，2000．
6．程夷．关于生物制品质量的回顾与展望[J]．微生物学免疫学进展，1994，22：39-42．
7．刘宇，高利臣，魏泓．羊胎提取液的实验研究[J]．中国生化药物杂志，2003，24(4)：170-172．
8．聂怀顺．羊胎素冻干粉及其生产方法[P]，中华人民共和国：98115761．0，1999年1月6日．
9. Lin YuanZao, Zhao Aiping, Chen Gengfu. Studies of Hepatitis B-virus Specific Transfer factor Preparation[J]. 药物生物技术，2000,7(3):141～145.
10．许代娣，李琪，何树生．胎盘免疫调节因子的制备[J]．广西医学，2001，23(4)：798-799．
11．杨秀芳，许牡丹，吴明鑫．活化羊胎素的提取和应用开发[J]．宝鸡文理学院学报(自然科学版)，1999，19(1)：40-41．
12．吴文惠．羊胎素提取工艺[P]，中华人民共和国：00105233．0，2000年11月15日．
13．西安阳光保健品开发有限责任公司．一种羊胎素针剂的制造方法[P]，中华人民共和国：98112918．8，2000年1月26日．
14．许代娣，李琪，何树生．胎盘免疫调节因子的制备[J]．广西医学，2001，23(4)：789-799．
15．国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．北京：化学工业出版社，2000．附录40-71．
16．尹幸念，解国梁，王莉等．羊胎盘粉的毒理学研究[J]．内蒙古医学杂志，1996，16(5)：265-266．
17．人胎盘组织液制造及检定规程[S]．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版暂行规程[M]．北京：化学工业出版社，2000，31—32
18．陆晖，闫晓梅，张双全．羊胎盘活细胞素微量元素和氨基酸组成的分析[J]．南京师大学报(自然科学版)，2001，24(1)：79-82．
19．郑健，陈焕文，刘宏伟等．紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用[J]．分析科学学报，2002，18(2)：158-163．
20．抗乙性肝炎胎盘转移因子注射液制造及检定规程[S]．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版2002增补本[M]．北京：化学工业出版社，2000，37-41．
21．抗乙性肝炎转移因子制造及检定规程[S]．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版暂行规程[M]．北京：化学工业出版社，2000，45—48．
22．刘刚，刘大涛．转移因子的性质研究[J]．吉林大学自然科学学报，2000，7(3)：104—106．
23．刘士山，张之周，朱和平等．羊胚胎盘肽功能测试[J]．中国生化药物杂志，2002，23(5)：236-238．
24．赖海昌，陈菁，赖文辉．猪脾转移因子多肽含量测定方法的改进[J]．广东药学院学报，1995，11(3)：188-189．
25．宋愿智，蔡晓民，崔玉绵．转移因子质量标准异同浅析[J]．西北药学杂志，2000，15(5)：219-220．
26．曾苏．生物药物分析方法的认证、质量控制及其标准操作规程[J]．中国医药工业杂志，1995，26(3)：136-139．
27．中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程2000年版[M]．北京：化学工业出版社，2000，29—40．
28．中国药学会．药品注册管理办法(试行)高级培训班讲义[M]北京：国家药品监督管理局，2002．
29. Hagan-RL. High performance liquid chromatography for small-scale studies of drug stability[J]. Am-J-Hosp-Pharm, 1994,51(1):2162-2175.
30. Kalghatgi K, Horvath C. Rapid analysis of proteins and peptides by reversed-phase chromato- graphy[J]. J Chromatogr A, 1987, 398:335-339
31．忻余，徐康森．高效液相色谱法测定尿多酸肽注射液小分子肽的分子量[J]．药物分析杂志，2001，21(3)：191-193．
32. Lee-K-R, Bongers-J, Gulati-D et al. Statistical validation of reproducibility of HPLC peptide mapping for the identity of an investigational drug compound based on principal component analysis[J]. Drug-Dev-Ind-Pharm. 2000, 26(10): 1045-1057.
33．2000国药标字XG-042号．胸腺肽溶液质量标准[S]．
34．2001国药标字WS-227(X-202)号．注射用促肝细胞生长素[S]．
35．邓兆群，闵磊，曹晓春等．口服抗乙肝转移因子免疫免疫生物活性研究[J]．氨基酸和生物资源，2001，23(1)：24-25．
36．李星，李伟，秦瑛等．人早期胚胎免疫生物活性因子抗肿瘤作用初步研究[J]．现代预防医学，1997，24(4)：403-440．
37．高利臣，刘宇，魏泓．羊胎免疫调节因子免疫生物活性的研究[J]．中国生化药物杂志，2004，25(2)：72-74．
38．黄楚华．殷学伦．胎盘肽制剂的理化性质及免疫免疫生物活性研究[J]．药物生物技
术，1995，2(2)：40—42．
39．林军，董湘兰．陈宁等．人胎盘免疫调节因子稳定性试验[J]．中国生化药物杂志，1998，19(2)：101～102．
40．陈奇．中药药理研究方法学[M]．北京：人民卫生出版社，1993．747～750．
41．刘丹，刘永强．两种鹿茸多肽生物学免疫生物活性检测方法的比较[J]．中国生物制品学杂志，2003，16(1)：46-47．
42．孙清河，李帆．曲利本兰在E玫瑰花环实验中的应用[J]．新乡医学院学报，2001，18(2)：141．
43．陈妍柯，王亚鹏，吴建中．E花环测定胸腺肽活性的剂量效应[J]．中国生化药物杂志，2001，22(5)：245-246．
44．曹红翠，许文荣，单玉荣等．MTT比色法测定血小板免疫活性的实验研究[J]．镇医学院学报，1998，8(3)：295-296．
45．姜圣亮，朱上林，王天翔等．MTT法应用于肝癌化学免疫治疗敏感性研究[J]．肿瘤，2001，21(1)：23-25．
46. C.A. Russell, L.L. Vindelov. Optimization and comparison of the MTT assay for the detection of IL-2 in helper T cell precursor assays[J].Journal of immunololgic methds 217(1998):165-175.
47. Ute Wagner, Eberhard Burkharddt, Klaus Failing. Evaluation of canine lymphocyte proliferation: comparison of three different colorimetric methods with the ~3H-thymidine incorporation assay[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 70(1999):151-159.
48．唐莉莉，杨严俊，马培松等．酶联免疫吸附技术用于蛋黄中免疫球蛋白免疫生物活性的测定[J]．Acta Nutrimenta Sinica，1999，21(3)：318-321．
49．白岚，姜云飞，孔宪涛。多抗-单抗夹心ELISA检测可溶性白介素-2受体，上海医学检验杂志，1994，9(1)：15-16。
50．李金屏．胸腺肽及其制剂的研究概况[J]．氨基酸和生物资源，1999，21(4)：29-33．
51．徐叔云，卞如濂，陈修。药理实验方法学(第三版)[M]．北京：人民卫生出版社，2002：1423。
52．李玲，刘健，周践等．从历版中国药典分析方法的统计与研究看我国药物分析方法的发展[J]．药物分析杂志，1998，18(5)：349-352．
53．张为宇，黄维义，Chauvin Alain．两种方法测定羊外周血淋巴细胞增殖的研究[J]．中国兽医杂志．2003，39(6)：3-6．
54．王国华，程往太，马红燕等．胎盘提取物促淋巴细胞增殖免疫生物活性及稳定性实验初探[J]．中国生化药物杂志，2001，22(3)：137-139．
55. Scheibenbogen C., Romero P, Rivoltinni, Herr W, Schmittel A, Cerottini, woelfel T, Eggermont AM, Keilholz U. Quantitattin ofantigenreactive T ceUs in periphral blood by IFN_r—ELISAPLOT assay and chromium release assay: a four-centre comparative trial[J]. ImmunoL. Methods, 2000, 244: 81-89.
56．林克江，刘智华，尤启冬．α、β多肽抗菌免疫生物活性的定量构效关系研究[J]．药物生物技术．2003，10(5)：299-303
57．刘杨，何华，倪坤仪．生化药物分析方法的现状与进展[J]．药学进展，2001，25(2)：71-75．
58．石继红，张英起，赵宁等．胸腺素a1的生化特性及生物学免疫生物活性的分析[J]．药物分析杂志，2001，21(4)：237-240．
59．丰慧根，李延冬，任太芳等．胎盘免疫调节肽的抗肿瘤作用[J]．中国生化药物杂志，1998，19(2)：82～83．
60．宋燕爽，杨毅，李川．人胚胎提取液生物学免疫生物活性研究及临床应用展望[J]中国肿瘤临床，1996，23(2)：92-96．
61．董伟，宋旭华，王录焕等．生物免疫生物活性肽-Pm 对小鼠免疫功能影响的探讨[J]．中国免疫学杂志，1999，11(8)：355．
62．葛轶群，俞建瑛，宋聿文等．生物免疫生物活性肽研究进展[J] 中国生化药物杂志，1998，19(6)：404—406．．
63．石继红，张英起，赵宁等．胸腺素α_1的生化特性及生物学免疫生物活性的分析[J]．药物分析杂志，2001，21(4)：237-240．
64．陆德源．现代免疫学[M]．上海：上海科学技术出版社，1995．29～137．
65．龚非力，裘法祖，吴在德，武忠弼．基础免疫学[M]．湖北：湖北科学技术出版社，1998．12．
66．江腊梅．胸腺素注射液免疫免疫生物活性测定实验的探讨[J]．中国生化药物杂志,2000,21(3)：140-141．
67．朱立平，陈学清．免疫学常用实验方法[M]．北京：人民军医出版社，2000: 175-180．
68．郝文琳，孙超 多肽抗生素在免疫系统中的作用[J]．中国药理学通报．2003．19(1)：1-5．
69. Gallin J I, Kirkpatrick C H. Chemotactic Activity in Dialyzable Transfer Factor[J]. Proc Nat Acad Sci, USA, 1974,71: 498-502.
70．吴凌，王国良，孙斌等．人和动物胎盘药理作用和临床应用的研究进展[J]．黑龙江八一农垦大学学报，2001，13(2)：68-71．
71. A P Biotech. Cell proliferation ELISA system, version 2[Z]. USA, 1988: 29-31.
72. Petraglia F, Georgieva R, Stefanov D et al. Effects of the whole extract and the chromatographic fractions of the pig placenta on lymphocyte proliferation and humoral immune response[J].J Clin Endocrinol metab, 1994,78: 205-211.
73. Georgieva. R, Michailova. A, Rasher. P, et al. Effects of the chromatographic
fractions of the pig placenta trophoblast on graft-versus-post reaction[J]. Theriogenology, 2000,88:1706-1715.
74. Banerjee KK, Bishayee A, Chatterjee M. Effects of human placenta extract on brain monoamines and monoamine oxidase activity in rats[J]. Tohoku J Exp Med, 1995, 176(1):17-24.
75．秦鹏春．哺乳动物胚胎学[M]．北京：科学出版社，2001．
76. Togashi S, Takahashi N, Lwama M, et al. Antioxidative Collagen-Derived Peptides In Human-Placenta Extract[J].Placenta, 2002,23: 497-50.
77．王凤山，张天民，李栽连等．人胚胸腺提取物的亚组分及其免疫免疫生物活性[J]．山东医科大学学报，1992，30(2)：159-161．
78. Nunn JF. Ancient egyptian medicine. University of Oklahoma Press[J]. 1996: 148-151.
79. Slemmon,-J-R, Flood,-D-G. Profiling of endogenous brain peptides and small proteins:methodogy, computer-assisted ananlysis, and application to aging and lesion models Neurobiol-Aging. 1992,13(6):649-600.
80. K. U. Ansari, Nira Gupta, S.K. Bapat. An experimental and lcinical evaluation of immuno-modulating potential of human placental extractIndia Jornal of pharmachology, 1994,26:130-132.
81. Sur TK, Biswas Tuhin Kanti, ALI Liaquat, MUKHERJEE Biswapati. Anti-inflammatory and anti-platelet agregation activity of human placenta extract[J]. Acta Phaarmacol Sin, 2003,24(2):187-192.
82. Biswas Tuhin Kanti, AUDDY Biswajit, BHATTACHARYA Nitai P, BHATTACHARYA Sunahshree, MUKHERJEE Biswapati. Wound healing activity of human placental extracts in rats[J]. Acta Phaarmacol Sin, 2001, 22(12): 1113-1116.