Dot-ELISA检测鸡新城疫抗体方法的建立与应用研究
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摘要
本研究用提纯的新城疫病毒和自制的酶标抗体建立了检测鸡新城疫抗体的Dot-ELISA方法。试验中用F_(48)E_9株和LaSota株提纯抗原并对两者进行了比较。以纯化的鸡IgG免疫兔，制备辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG。抗原最适包被浓度为8.9μg/ml，酶标抗体最适工作浓度为1：400，确定了其他反应试剂和各步的最佳反应时间。阻断试验和交叉试验表明快诊膜具有良好的特异性：不与马立克、法氏囊、鸡痘、鸡传支、鸡传喉、鸡减蛋综合症、鸡传鼻、鸡沙门氏菌等阳性血清反应。批内和批间重复性试验表明该法重复性良好。诊断膜片4℃至少可保存6个月，其特异性、灵敏性不变。检测150份血清，Dot-ELISA阳性92份(占61.3％)；HI阳性77份(占51.3％)，Dot-ELISA检出的抗体滴度比HI高2～4个滴度，初步确定了该方法的临界保护值为1：64。本法检测抗体2.5小时内即可完成，结果客观，肉眼容易判定，不需要特殊仪器。结果表明Dot-ELISA简便、快速、灵敏、特异，重复性好，稳定可靠，快诊膜便于寄送、保存；各种试剂和材料都可作到标准化。诊断该方法适合基层单位用于新城疫抗体监测、诊断和疫病普查。
A dot-enzyme-linked immnosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of antidodies against Newcastle Diesease Virus (NDV) was established by using purified NDV and self-made enzyme-labeled anti-chicken IgG, The mehod was also evaluated through it's application. In the studies, the virulent F48E9 strain and avirulent LaSota strain were used for purifying antigen and comparision was done between them.Different methods had been used to purify antigen and the discontinuous sucrose density gradieng was determined to be the optimal one. Purified chicken IgG was used to immune rabbits ,then the rabbit antichicken IgG was purified and the rabbit antichicken IgG conjugated with HRP was made. The optimum conditions of Dot-ELISA was determined:the optimal coating concentration was 8.9 u g/ml ,1:400 was the best working concentration of HRP-laleled rabbit antichicken IgG,the other steps and reagentes were also optimized. The high specificity of Dot-ELISA was proved by the specific blocking test and the cross-reaction te
st in which the diagnostic diaphragm didn't react with the positive serum against IBDV, IBV,EDS-76,Pox ,IBV,ILTV, Salmonellosis JC.Both the test within batch and the test among batches proved the method or the diagnostic diaphragm was stable .Stored at 4C for at least 6 months ,the diagnostic diaphragm's sensitivity and specificity didn't change. Parallel test was done between Dot-ELISA and heamagglutination test (HI) by using them to detect 150 serum ,the result show 92 serum were positive (the positive rate is 61.3%)by Dot-ELISA while only 77 serum was positive (the positive rate is 51.3%); Among the positive serum ,the serum titers by Dot-ELISA were 2 to 4 tilers higher than that by HI .Through parallel test ,1:128 was preliminarily detennned to be the crical defensive point of Dot-ELISA.Using Dot-ELISA to detect antibody can be finished within 2.5 hours and the result can be determined by naked
eye without needing special instruments.
All the results above have shown that Dot-ELISA has many advantages.Firstly,it is a convenient ,rapid .sensitive .specific method for detecting antibody.Besides,the diagnostic diaphragm is convenient to post or store because of it's stability. Fourhtermore ,all the materials and reagents can be easily standardized . So Dot-ELISA is believed to be very useful for the surveillane of antibody against NDV, epidemiologic investigation etc.
A dot-enzyme-linked immnosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of antidodies against Newcastle Diesease Virus (NDV) was established by using purified NDV and self-made enzyme-labeled anti-chicken IgG, The mehod was also evaluated through it's application. In the studies, the virulent F48E9 strain and avirulent LaSota strain were used for purifying antigen and comparision was done between them.Different methods had been used to purify antigen and the discontinuous sucrose density gradieng was determined to be the optimal one. Purified chicken IgG was used to immune rabbits ,then the rabbit antichicken IgG was purified and the rabbit antichicken IgG conjugated with HRP was made. The optimum conditions of Dot-ELISA was determined:the optimal coating concentration was 8.9 u g/ml ,1:400 was the best working concentration of HRP-laleled rabbit antichicken IgG,the other steps and reagentes were also optimized. The high specificity of Dot-ELISA was proved by the specific blocking test and the cross-reaction te
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引文
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