基于“肾主骨生髓”理论的补肾中药联合BMP-2诱导人脐血MSCs体外成骨分化的研究
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摘要
目的：建立人脐血间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,观察体外培养人脐血间充质干细胞的生物学特性及补肾中药与BMP-2联合作用对人脐血间充质干细胞增殖、成骨活性的影响,探讨其对人脐血间充质干细胞定向成骨分化的诱导作用。
方法：取30只SD大鼠,补肾中药连续灌胃7天,颈总动脉取血制备补肾中药血清。采集人脐血标本,密度梯度离心法分离人脐血MSCs,倒置相差显微镜下观察体外培养人脐血MSCs的生物学特性,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,取第3代人脐血MSCs分为8组,即空白对照组、5%中药血清组、10%中药血清组、15%中药血清组,5%中药血清+50ng/mlBMP-2组、10%中药血清+50ng/mlBMP-2组、15%中药血清+50ng/mlBMP-2组、50ng/mlBMP-2组。分别于诱导后1d、3d、5d采用MTT法检测不同条件对人脐血MSCs增殖的影响,诱导后3d、6d、9d、12d通过碱性磷酸酶染色及矿化结节Von Kossa染色观察人脐血MSCs定向成骨分化的成骨活性,放射免疫法计算各组培养液内骨钙素(BGP)含量,钙离子荧光探针技术检测成骨细胞内钙离子分泌情况及免疫组织化学染色分析检测各组中成骨细胞Ⅰ型胶原的表达。
结果：①原代培养的人脐血MSCs呈圆形,72h后仅见少量贴壁细胞,近似圆形或椭圆形,7d后首次换液可见分散的MSCs小集落,呈放射状生长。2周时细胞形态呈长梭形,3周后细胞集落彼此融合。传代细胞大部分24h内贴壁,一般3d即可达到80%-90%融合,细胞排列紧密,以梭形为主。
②在第3d和第5d时,5%、10%中药血清+BMP-2组和BMP-2组均能够促进人脐血MSCs的增值(P<0.05),尤以5%中药+BMP-2组、BMP-2为佳(P<0.01),且5%中药+BMP-2组优于BMP-2组,第5d两者比较差异有统计学意义(P=0.041<0.05)。各中药血清组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
③诱导后第6d、9d、12d,与对照组比较,BMP-2组均能提高培养细胞上清的骨钙素(BGP)含量,差异有统计学意义(P值分别为0.049、0.012、0.021<0.05)。而5%中药血清+BMP-2组在诱导第9d时的BGP含量与对照组比较差异有显著性意义(P=0.004<0.01),作用最为显著。
④诱导后各组ALP活性逐渐增强,与对照组比较,BMP-2组、补肾中药与BMP-2联合组在诱导后3、6、9、12d均能提高ALP活性(P<0.05)；5%中药血清+BMP-2组在诱导第6d时ALP活性与BMP-2组比较,差异有统计学意义(P=0.011<0.05)。
第7d ALP染色阳性表达较弱,第14d ALP染色呈阳性,细胞浆内出现弥散性红棕色或咖啡色颗粒,但强弱不等,其中对照组阳性表达较弱,5%补肾中药联合BMP-2及BMP-2组较为显著,而联合组阳性表达最优,第21d染色阳性表达有所减弱。
⑤诱导后第14d von Kossa染色可见细胞间散在黑色颗粒,颗粒大小不均一,对照组细胞von Kossa染色未见黑色矿化物沉积。其中5%补肾中药联合BMP-2组较其他各组明显。
⑥钙离子荧光探针技术检测显示BMP-2组及补肾中药联合BMP-2组细胞内钙离子分泌多于对照组及单纯补肾中药组。其中5%补肾中药联合BMP-2组荧光强度最为明显。
⑦免疫组织化学染色Ⅰ型胶原阳性表达为棕黄色颗粒,BMP-2组和5%补肾中药+BMP-2组均呈阳性表达,单纯补肾中药组和对照组表达则不明显。
结论：BMP-2、补肾中药与BMP-2联合均能够促进人脐血间充质干细胞的增殖,诱导人脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,单纯补肾中药此作用不明显,而补肾中药与BMP-2联合应用较单纯BMP-2在这两方面的作用较为显著。结果提示补肾中药联合BMP-2诱导人脐血间充质于细胞定向成骨分化的方法有效可行,印证了中医“肾主骨生髓”理论的科学性,为中医药与现代组织工程技术有机结合提供了一定的借鉴和参考,丰富了骨缺损修复重建的治疗手段。
Objective:To establish culture system for the human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (UCB-MSCs), observe the biological characteristics, proliferation, osteogenic activity of UCB-MSCs induced by Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2in vitro, and explore its effect on transformation of UCB-MSCs into osteoblasts.
Methods:30SD rats were given with Chinese kidney-tonifying herbs by gavage for7days, taking carotid arterial blood to make Chinese kidney-tonifying herbs serum, collecting human umbilical cord blood samples under sterile conditions and separating UCB-MSCs by density gradient centrifugation. The biological characteristics of cultured UCB-MSCs in vitro were observed under inverted phase contrast microscope and identified by flow cytometry.The3rd generation of UCB-MSCs were divided into eight groups:control group,5%,10%,15%Chinese kidney-tonifying herbs serum group;5%,10%,15%Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2group and BMP-2group. To observe the influence of each group on proliferation of UCB-MSCs on the induction of1st,3rd and5th day by MTT assay, osteoblast activity of UCB-MSCs by alkaline phosphatase and mineralized nodulesVonKossa staining method,osteocalcin (BGP) content in the culture medium measured via radioimmuno assay, the secretion of calcium in osteoblasts detected by calcium fluorescence probe,the expression of type I collagen detected by immune histochemical staining method on3,6,9,12days after induction.
Results:①he primary culture cells of UCB-MSCs were round.72hours after primary culture,only a small amount of adherent cells were seen round or oval. The medium was changed for the first time on the7th, in which can be seen scattered MSCs radial growth. After two weeks the cell morphology were fusiform, colony fusion with each other after three weeks, Most of Passage cells were adherented in24hours.Generally, they can reach80%to90%confluence in3days, packed tightly, and the form is relatively uniform,mostly spindle.
②Compared with the control group,5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group,10%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group,BMP-2group was able to promote proliferation of the UCB-MSCs on the induction of3rd,5th(P＜0.05), and especially the5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group was best (P＜0.01).There was significant difference between5%Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2group and BMP-2group (P=0.041<0.05).However, the difference was not statistically significant between Chinese kidney-tonifying herbs serum group and the control group (P>0.05).
③Both BMP-2group and5%Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2group on the6th,9th and12th after induction can improve the content of the osteocalcin(BGP).Compared with control group,there was significant difference (P=0.049、0.012、0.021＜O.05).9days after induction,5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group had statistically significant difference (P=0.004<0.01) compared with control group.
④The ALP activity of each group gradually strengthened after induction. Compared with control group, BMP-2group and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group both could improve ALP activity on the3rd,6th,9th, and12th day after induction (P＜0.05). There was significant difference between5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group and BMP-2group6days after induction (P=0.011＜0.05).
The positive expression of ALP staining was weaker in7days after induction,but relatively obvious on day14. Diffuse reddish brown or coffee colored particles were expressed in the cytoplasm,but the strength showed difference among these groups. The effect of5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group was superior to that of other groups.On day21after induction,the expression of ALP staining slightly decreased.
⑤Black particles were found in the positive cells of Von Kossa staining of mineralized nodules14days after induction. The positive expression of Von Kossa staining was significantly obvious in BMP-2and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2groups. The particle size was inequable. Black mineralizer deposit weren't expressed in the Von Kossa staining cells in control group.
⑥luorescent probe technology showed that the content of calciumion of all the BMP-2group and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group were superior to that of control group and simple Chinese kidney-tonifying herbs group. The fluorescence intensity of5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group was most obvious
⑦Immunohistochemistry showed that the positive expression of type Ⅰ collagen was manifested as brownish yellow granules,which was mainly localized in extracellular matrix. BMP-2and5%Chinese Kidney-tonifying Herbs combined with BMP-2group all showed positive expression,but simple Chinese kidney-tonifying herbs group and control group were not obvious.
Conclusion:BMP-2and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2both are able to promote the proliferation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells and can induce human umbilical cord blood mesenchymal stem cell into osteoblasts.The effect of Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2is superior to that of BMP-2,but that of Simple Chinese kidney-tonifying herbs is not obvious. The results suggest that the Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2can effectively induce human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into osteoblast, which verify the scientific nature of the theory of "kidney controlling bones and producing bone marrow" and provide a certain guiding and reference for the combination of traditional chinese medicine and tissue engineering technology,and then enrich the treatment means of the repair and reconstruction of the bone defect.
方法：取30只SD大鼠,补肾中药连续灌胃7天,颈总动脉取血制备补肾中药血清。采集人脐血标本,密度梯度离心法分离人脐血MSCs,倒置相差显微镜下观察体外培养人脐血MSCs的生物学特性,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,取第3代人脐血MSCs分为8组,即空白对照组、5%中药血清组、10%中药血清组、15%中药血清组,5%中药血清+50ng/mlBMP-2组、10%中药血清+50ng/mlBMP-2组、15%中药血清+50ng/mlBMP-2组、50ng/mlBMP-2组。分别于诱导后1d、3d、5d采用MTT法检测不同条件对人脐血MSCs增殖的影响,诱导后3d、6d、9d、12d通过碱性磷酸酶染色及矿化结节Von Kossa染色观察人脐血MSCs定向成骨分化的成骨活性,放射免疫法计算各组培养液内骨钙素(BGP)含量,钙离子荧光探针技术检测成骨细胞内钙离子分泌情况及免疫组织化学染色分析检测各组中成骨细胞Ⅰ型胶原的表达。
结果：①原代培养的人脐血MSCs呈圆形,72h后仅见少量贴壁细胞,近似圆形或椭圆形,7d后首次换液可见分散的MSCs小集落,呈放射状生长。2周时细胞形态呈长梭形,3周后细胞集落彼此融合。传代细胞大部分24h内贴壁,一般3d即可达到80%-90%融合,细胞排列紧密,以梭形为主。
②在第3d和第5d时,5%、10%中药血清+BMP-2组和BMP-2组均能够促进人脐血MSCs的增值(P<0.05),尤以5%中药+BMP-2组、BMP-2为佳(P<0.01),且5%中药+BMP-2组优于BMP-2组,第5d两者比较差异有统计学意义(P=0.041<0.05)。各中药血清组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
③诱导后第6d、9d、12d,与对照组比较,BMP-2组均能提高培养细胞上清的骨钙素(BGP)含量,差异有统计学意义(P值分别为0.049、0.012、0.021<0.05)。而5%中药血清+BMP-2组在诱导第9d时的BGP含量与对照组比较差异有显著性意义(P=0.004<0.01),作用最为显著。
④诱导后各组ALP活性逐渐增强,与对照组比较,BMP-2组、补肾中药与BMP-2联合组在诱导后3、6、9、12d均能提高ALP活性(P<0.05)；5%中药血清+BMP-2组在诱导第6d时ALP活性与BMP-2组比较,差异有统计学意义(P=0.011<0.05)。
第7d ALP染色阳性表达较弱,第14d ALP染色呈阳性,细胞浆内出现弥散性红棕色或咖啡色颗粒,但强弱不等,其中对照组阳性表达较弱,5%补肾中药联合BMP-2及BMP-2组较为显著,而联合组阳性表达最优,第21d染色阳性表达有所减弱。
⑤诱导后第14d von Kossa染色可见细胞间散在黑色颗粒,颗粒大小不均一,对照组细胞von Kossa染色未见黑色矿化物沉积。其中5%补肾中药联合BMP-2组较其他各组明显。
⑥钙离子荧光探针技术检测显示BMP-2组及补肾中药联合BMP-2组细胞内钙离子分泌多于对照组及单纯补肾中药组。其中5%补肾中药联合BMP-2组荧光强度最为明显。
⑦免疫组织化学染色Ⅰ型胶原阳性表达为棕黄色颗粒,BMP-2组和5%补肾中药+BMP-2组均呈阳性表达,单纯补肾中药组和对照组表达则不明显。
结论：BMP-2、补肾中药与BMP-2联合均能够促进人脐血间充质干细胞的增殖,诱导人脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,单纯补肾中药此作用不明显,而补肾中药与BMP-2联合应用较单纯BMP-2在这两方面的作用较为显著。结果提示补肾中药联合BMP-2诱导人脐血间充质于细胞定向成骨分化的方法有效可行,印证了中医“肾主骨生髓”理论的科学性,为中医药与现代组织工程技术有机结合提供了一定的借鉴和参考,丰富了骨缺损修复重建的治疗手段。
Objective:To establish culture system for the human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (UCB-MSCs), observe the biological characteristics, proliferation, osteogenic activity of UCB-MSCs induced by Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2in vitro, and explore its effect on transformation of UCB-MSCs into osteoblasts.
Methods:30SD rats were given with Chinese kidney-tonifying herbs by gavage for7days, taking carotid arterial blood to make Chinese kidney-tonifying herbs serum, collecting human umbilical cord blood samples under sterile conditions and separating UCB-MSCs by density gradient centrifugation. The biological characteristics of cultured UCB-MSCs in vitro were observed under inverted phase contrast microscope and identified by flow cytometry.The3rd generation of UCB-MSCs were divided into eight groups:control group,5%,10%,15%Chinese kidney-tonifying herbs serum group;5%,10%,15%Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2group and BMP-2group. To observe the influence of each group on proliferation of UCB-MSCs on the induction of1st,3rd and5th day by MTT assay, osteoblast activity of UCB-MSCs by alkaline phosphatase and mineralized nodulesVonKossa staining method,osteocalcin (BGP) content in the culture medium measured via radioimmuno assay, the secretion of calcium in osteoblasts detected by calcium fluorescence probe,the expression of type I collagen detected by immune histochemical staining method on3,6,9,12days after induction.
Results:①he primary culture cells of UCB-MSCs were round.72hours after primary culture,only a small amount of adherent cells were seen round or oval. The medium was changed for the first time on the7th, in which can be seen scattered MSCs radial growth. After two weeks the cell morphology were fusiform, colony fusion with each other after three weeks, Most of Passage cells were adherented in24hours.Generally, they can reach80%to90%confluence in3days, packed tightly, and the form is relatively uniform,mostly spindle.
②Compared with the control group,5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group,10%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group,BMP-2group was able to promote proliferation of the UCB-MSCs on the induction of3rd,5th(P＜0.05), and especially the5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group was best (P＜0.01).There was significant difference between5%Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2group and BMP-2group (P=0.041<0.05).However, the difference was not statistically significant between Chinese kidney-tonifying herbs serum group and the control group (P>0.05).
③Both BMP-2group and5%Chinese kidney-tonifying herbs serum combined with BMP-2group on the6th,9th and12th after induction can improve the content of the osteocalcin(BGP).Compared with control group,there was significant difference (P=0.049、0.012、0.021＜O.05).9days after induction,5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group had statistically significant difference (P=0.004<0.01) compared with control group.
④The ALP activity of each group gradually strengthened after induction. Compared with control group, BMP-2group and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group both could improve ALP activity on the3rd,6th,9th, and12th day after induction (P＜0.05). There was significant difference between5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group and BMP-2group6days after induction (P=0.011＜0.05).
The positive expression of ALP staining was weaker in7days after induction,but relatively obvious on day14. Diffuse reddish brown or coffee colored particles were expressed in the cytoplasm,but the strength showed difference among these groups. The effect of5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group was superior to that of other groups.On day21after induction,the expression of ALP staining slightly decreased.
⑤Black particles were found in the positive cells of Von Kossa staining of mineralized nodules14days after induction. The positive expression of Von Kossa staining was significantly obvious in BMP-2and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2groups. The particle size was inequable. Black mineralizer deposit weren't expressed in the Von Kossa staining cells in control group.
⑥luorescent probe technology showed that the content of calciumion of all the BMP-2group and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group were superior to that of control group and simple Chinese kidney-tonifying herbs group. The fluorescence intensity of5%Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2group was most obvious
⑦Immunohistochemistry showed that the positive expression of type Ⅰ collagen was manifested as brownish yellow granules,which was mainly localized in extracellular matrix. BMP-2and5%Chinese Kidney-tonifying Herbs combined with BMP-2group all showed positive expression,but simple Chinese kidney-tonifying herbs group and control group were not obvious.
Conclusion:BMP-2and Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2both are able to promote the proliferation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells and can induce human umbilical cord blood mesenchymal stem cell into osteoblasts.The effect of Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2is superior to that of BMP-2,but that of Simple Chinese kidney-tonifying herbs is not obvious. The results suggest that the Chinese kidney-tonifying herbs combined with BMP-2can effectively induce human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into osteoblast, which verify the scientific nature of the theory of "kidney controlling bones and producing bone marrow" and provide a certain guiding and reference for the combination of traditional chinese medicine and tissue engineering technology,and then enrich the treatment means of the repair and reconstruction of the bone defect.
引文
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