桔梗植株再生体系的建立（附：山茱萸种质资源调查研究）
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摘要
桔梗 Platycodon grandiflorum(Jacq．)A．DC．(P．glaucum Nakai)属桔梗科(Campanulaceae)，多年生草本植物，是一种常用的重要中药材，其根入药，有润肺、散寒、祛痰、排脓等功效，其中含有多种氨基酸与人体必需微量元素，以及大量亚油酸等不饱和脂肪酸，具有降压降脂、抗动脉粥样硬化等多种作用。本实验对桔梗组织培养进行了系统的研究，建立了其植株再生体系，并对液体培养条件下其生理活性和有效成分累积情况进行了研究，同时还探讨了桔梗总皂甙的提取条件，筛选了桔梗转基因过程中抗生素的浓度、除菌条件等。实验结果如下：
1．利用桔梗叶片、茎段为外植体，对其开展了组织培养及植株再生的研究，筛选出了愈伤组织、不定芽、芽的增殖和生根的较佳培养条件，建立了比较简单可行的桔梗组织培养及植株再生体系，其中培养基MS+2，4-D 2mg／L+6-BA0.5mg／L+NAA 1mg／L+IAA 0.5mg／L上诱导叶片愈伤组织，诱导率可达95.9％；培养基MS+2，4-D 1mg／L+6-BA 1.5mg／L+NAA 0.2mg／L+IAA 0.5mg／L上诱导茎段愈伤组织，诱导率可达92.8％。论文还对桔梗愈伤组织的盐耐受性进行了初探。
2．在桔梗愈伤组织液体培养条件下，对其组织细胞的增殖、生理活性和次生代谢产物含量进行了测定，为利用桔梗细胞大规模生产次生代谢产物奠定了一定的实验基础。
3．优化了桔梗皂甙的提取方法、提取溶剂等条件，并采用薄层层析法进行了验证，较好的方法是用甲醇超声提取60min。
4．测定了陕西境内三个桔梗主产地(商洛、汉中及安康)的桔梗药材的总皂甙含量，结果显示：商洛地区的桔梗皂甙含量略高于其它两个产地。
5．以叶片、茎段为外植体，研究了不同抗生素对桔梗愈伤组织诱导及增殖的影响。结果表明，卡那霉素对桔梗愈伤组织的诱导及增殖有不同程度的抑制作用，头孢曲松钠对组织分化生芽有一定的抑制作用；不同外植体对抗生素的敏感程度不同，其中桔梗叶片对卡那霉素的敏感性高于茎段，而叶片与茎段对头孢曲松钠的敏感性几乎一致。
6．筛选出了用于转基因过程适宜的抗生素浓度，得出：在以愈伤组织为外植体进行转化时，选择因子卡那霉素浓度应设定为25mg／L；在以茎段与叶片为外植体诱导愈伤组织进行转化时，选择因子卡那霉素浓度应该分别设定为50mg／L和
25mg/L;以两者为外植体诱导不定芽进行转化时，选择因子卡那霉素浓度应该设
定为50 mg/L(茎段为外植体)、25mg/L(叶片为外植体);在进行抑菌处理时，
建议将头抱曲松钠浓度设定为400 mg/L。
山茱英(Cornus officinalis sieb.Et zucc)属山茱英科(eornaceae)落叶乔木，是
一种常用的名贵中药材，其药用部分主要为干燥的果实。山茱英具有降血糖、抗
衰老、增强免疫机能的作用，可用于治疗失眠、糖尿病及其他炎症，药用价值极
高。本文系统调查了山茱英源产地陕西佛坪县境内现有资源状况，针对结果期不
同产地、品种和时期的种实性状进行了研究，作出了初步的种质评价，为进行山
茱英的规范化种植(GAP)奠定了一定的基础。
Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. (P. glaucum Nakai)is a kind of commonly used important traditional Chinese medicine, Perennial herb, which belongs to Campanulaceae and whose root is used as medicine of eliminating the phlegm, arranging efficiency, moistening the lung , breaking up suppuration and so on. It contains kinds of amino acid and essential trace elements that the human body needs. And it contains too a great quantity of unsaturated fat acid such as a large amount of inferior oleic acid, etc., which can reduce blood pressure and grease, resist scleratheroma and other kinds of function. The experiment trains systematic research to Platycodon grandiflorum, its tissue culture and plant regeneration system have been established and perfected. Moreover, such physiology activation and accumulation situation of valid components have been researched in liquid medium. And technology of total saponin from Platycodon grandiflorum and the concentration of antibiotic in course of trans-genes are c
hosen out in the preliminary research. The main results of the experiment are as follows:
1. With the explants of the leaf and stem, terms of induction of callus, adventitious buds, proliferation of buds and rooting are selected out, And relatively simple and feasible Platycodon grandiflorum tissue culture and plant regeneration system is established: The medium of MS+2,4-D 2mg/L + 6-BA 0.5mg/L + NAA Img/L +IAA 0.5mg/L can induct leaf-callus, induction rate is 95.9%; The medium of MS+2,4-D Img/L + 6-BA 1.5mg/L + NAA 0.2mg/L +IAA 0.5mg/L can induct stem-callus, induction rate is 92.8%. Moreover, anti-salt quality of callus has been explored initially.
2. The hyperplasia, physiology activation and accumulation situation of valid components of callus of Platycodon grandiflorum in liquid foster have been measured. Utilizing the callus cells in large-scale production of valid components will remain and research further.
3. The technology and solvent of total saponin from Platycodon grandiflorum have been optimized. Moreover, the results have been verified by the way of slight layer. In conclusion, the best means is abstracted 60 minutes with the supersound of methyl alcohol.
4. At the same time, in three main origin place of the boundary of the Shaanxi, content of total saponin has been compared. Shangluo's is slightly higher than two other places.
5. Utilizing the leaf and stem ofPlatycodon grandiflorum as explantss, effects of
different antibiotic to induction and propagation of callus are researched. It shows: Inhibition to induction and propagation of callus in different degrees from Kanamycin and to induction of buds from ceftriaxone sodium has been found; Different explants confronted with antibiotic have different sensitivity: Leaf has higher sensitiveness than stem to kanamycin, a section of sensitivity of ceftriaxone sodium of blade and stem is nearly unanimous.
6. The suitable concentrations of antibiotic used in the trans-genes have been selected out, conclusions are: When transforming with callus as explants, concentration of selective factor should be set for 25 mg/L Kanamycin; When transforming with stem and leaf as explants inducted callus, concentration of choose-factor should be set for 50mg/L and 25 mg/L Kanamycin separately; When transforming with them as explants inducted adventitious buds, concentration of selective factor should be set for 50mg/L and 25 mg/L Kanamycin separately;When restraining fungus, concentration of ceftriaxone sodium is proposed and settled as 400 mg/L.
Cornus officinalis Sieb.Et Zucc is a common and rare traditional Chinese herbal drug, deciduous tree, which belongs to Cornaceae , whose dry drupe is used as medicine and has extremely high medical value, such as dropping blood sugar, anti-ageing function, strengthening the immunity function ,being used for treating insomnia, diabetes and other inflammations. Investigation and Exploitation of existing Cornus officinalis Sieb.Et Zucc plant resource state are systematically surveyed in the boundary of distinct original
1．利用桔梗叶片、茎段为外植体，对其开展了组织培养及植株再生的研究，筛选出了愈伤组织、不定芽、芽的增殖和生根的较佳培养条件，建立了比较简单可行的桔梗组织培养及植株再生体系，其中培养基MS+2，4-D 2mg／L+6-BA0.5mg／L+NAA 1mg／L+IAA 0.5mg／L上诱导叶片愈伤组织，诱导率可达95.9％；培养基MS+2，4-D 1mg／L+6-BA 1.5mg／L+NAA 0.2mg／L+IAA 0.5mg／L上诱导茎段愈伤组织，诱导率可达92.8％。论文还对桔梗愈伤组织的盐耐受性进行了初探。
2．在桔梗愈伤组织液体培养条件下，对其组织细胞的增殖、生理活性和次生代谢产物含量进行了测定，为利用桔梗细胞大规模生产次生代谢产物奠定了一定的实验基础。
3．优化了桔梗皂甙的提取方法、提取溶剂等条件，并采用薄层层析法进行了验证，较好的方法是用甲醇超声提取60min。
4．测定了陕西境内三个桔梗主产地(商洛、汉中及安康)的桔梗药材的总皂甙含量，结果显示：商洛地区的桔梗皂甙含量略高于其它两个产地。
5．以叶片、茎段为外植体，研究了不同抗生素对桔梗愈伤组织诱导及增殖的影响。结果表明，卡那霉素对桔梗愈伤组织的诱导及增殖有不同程度的抑制作用，头孢曲松钠对组织分化生芽有一定的抑制作用；不同外植体对抗生素的敏感程度不同，其中桔梗叶片对卡那霉素的敏感性高于茎段，而叶片与茎段对头孢曲松钠的敏感性几乎一致。
6．筛选出了用于转基因过程适宜的抗生素浓度，得出：在以愈伤组织为外植体进行转化时，选择因子卡那霉素浓度应设定为25mg／L；在以茎段与叶片为外植体诱导愈伤组织进行转化时，选择因子卡那霉素浓度应该分别设定为50mg／L和
25mg/L;以两者为外植体诱导不定芽进行转化时，选择因子卡那霉素浓度应该设
定为50 mg/L(茎段为外植体)、25mg/L(叶片为外植体);在进行抑菌处理时，
建议将头抱曲松钠浓度设定为400 mg/L。
山茱英(Cornus officinalis sieb.Et zucc)属山茱英科(eornaceae)落叶乔木，是
一种常用的名贵中药材，其药用部分主要为干燥的果实。山茱英具有降血糖、抗
衰老、增强免疫机能的作用，可用于治疗失眠、糖尿病及其他炎症，药用价值极
高。本文系统调查了山茱英源产地陕西佛坪县境内现有资源状况，针对结果期不
同产地、品种和时期的种实性状进行了研究，作出了初步的种质评价，为进行山
茱英的规范化种植(GAP)奠定了一定的基础。
Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. (P. glaucum Nakai)is a kind of commonly used important traditional Chinese medicine, Perennial herb, which belongs to Campanulaceae and whose root is used as medicine of eliminating the phlegm, arranging efficiency, moistening the lung , breaking up suppuration and so on. It contains kinds of amino acid and essential trace elements that the human body needs. And it contains too a great quantity of unsaturated fat acid such as a large amount of inferior oleic acid, etc., which can reduce blood pressure and grease, resist scleratheroma and other kinds of function. The experiment trains systematic research to Platycodon grandiflorum, its tissue culture and plant regeneration system have been established and perfected. Moreover, such physiology activation and accumulation situation of valid components have been researched in liquid medium. And technology of total saponin from Platycodon grandiflorum and the concentration of antibiotic in course of trans-genes are c
hosen out in the preliminary research. The main results of the experiment are as follows:
1. With the explants of the leaf and stem, terms of induction of callus, adventitious buds, proliferation of buds and rooting are selected out, And relatively simple and feasible Platycodon grandiflorum tissue culture and plant regeneration system is established: The medium of MS+2,4-D 2mg/L + 6-BA 0.5mg/L + NAA Img/L +IAA 0.5mg/L can induct leaf-callus, induction rate is 95.9%; The medium of MS+2,4-D Img/L + 6-BA 1.5mg/L + NAA 0.2mg/L +IAA 0.5mg/L can induct stem-callus, induction rate is 92.8%. Moreover, anti-salt quality of callus has been explored initially.
2. The hyperplasia, physiology activation and accumulation situation of valid components of callus of Platycodon grandiflorum in liquid foster have been measured. Utilizing the callus cells in large-scale production of valid components will remain and research further.
3. The technology and solvent of total saponin from Platycodon grandiflorum have been optimized. Moreover, the results have been verified by the way of slight layer. In conclusion, the best means is abstracted 60 minutes with the supersound of methyl alcohol.
4. At the same time, in three main origin place of the boundary of the Shaanxi, content of total saponin has been compared. Shangluo's is slightly higher than two other places.
5. Utilizing the leaf and stem ofPlatycodon grandiflorum as explantss, effects of
different antibiotic to induction and propagation of callus are researched. It shows: Inhibition to induction and propagation of callus in different degrees from Kanamycin and to induction of buds from ceftriaxone sodium has been found; Different explants confronted with antibiotic have different sensitivity: Leaf has higher sensitiveness than stem to kanamycin, a section of sensitivity of ceftriaxone sodium of blade and stem is nearly unanimous.
6. The suitable concentrations of antibiotic used in the trans-genes have been selected out, conclusions are: When transforming with callus as explants, concentration of selective factor should be set for 25 mg/L Kanamycin; When transforming with stem and leaf as explants inducted callus, concentration of choose-factor should be set for 50mg/L and 25 mg/L Kanamycin separately; When transforming with them as explants inducted adventitious buds, concentration of selective factor should be set for 50mg/L and 25 mg/L Kanamycin separately;When restraining fungus, concentration of ceftriaxone sodium is proposed and settled as 400 mg/L.
Cornus officinalis Sieb.Et Zucc is a common and rare traditional Chinese herbal drug, deciduous tree, which belongs to Cornaceae , whose dry drupe is used as medicine and has extremely high medical value, such as dropping blood sugar, anti-ageing function, strengthening the immunity function ,being used for treating insomnia, diabetes and other inflammations. Investigation and Exploitation of existing Cornus officinalis Sieb.Et Zucc plant resource state are systematically surveyed in the boundary of distinct original
引文
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