大白菜组织培养和遗传转化体系的建立的研究
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摘要
本试验从大白菜四个品种：天津青麻叶、南宁早熟5号、50天快菜和浙江早
熟5号入手，从材料灭菌到大白菜转基因体系的建立，系统地研究了大白菜的再
生体系和根癌农杆菌介导的遗传转化体系，成功地获得了转GUS基因的大白菜植
株，并通过了鉴定。
通过对影响大白菜外植体再生的品种、灭菌剂、灭菌时间、浸种时间、植物
激素、乙烯抑制剂、培养基基本成分等诸多因素的对比试验，已建立起四个大白
菜品种的高效再生体系：种子先经70%乙醇处理1分钟，再用0.1%升汞溶液处理
12─15 分钟，进行表面灭菌；浸种20─22小时，然后接种在MS和
1/2MS＋GA0.2mg／L培养基上，获得无菌苗；取6─8天苗龄的无菌苗切下子叶外
植体，接种在附加NAA0.3mg／L＋6－BA4.0gm／L＋TDZ0.2mg／L＋AgNO34.0mg／L的
MS培养基上，进行光照培养。20天左右子叶外植体开始分化出芽。芽分化率因
品种不同而有差异，其中：天津青麻叶为31.3%；南宁早熟5号为32.0%；50天
快菜为47.9%；浙江早熟为48.1%。子叶外植体的芽分化率以50天快菜和浙江早
熟5号为高，故此以这两个品种作为转基因的试验材料。本试验还首次将新的高
活性细胞分裂素──TDZ引入大白菜再生培养中，芽分化率最高可提高169%，
取得了良好的培养效果。
农杆菌介导的植物遗传转化方法进行大白菜外植体的遗传转化。通
过对遗传转化过程中影响转化频率的筛选剂、根癌农杆菌生长状态、菌液浓度培
养时间等重要因素的研究，建立起以浙江早熟5号和50天快菜大白菜子叶为外植
体的一套可操作的遗传转化体系：挑单菌落接种根癌农杆菌菌株于三抗液体培养
基中，经28℃下200rpm振荡培养过夜，转接于不含抗生素的YEB培养基中，在
28℃培养3─5小时，OD600为0.6左右；取菌液稀释10倍，取7天苗龄的无菌苗，
切取子叶外植体；然后将子叶外植体浸泡侵染10分钟，吸干外植体上的菌液，共
培养两天后转入含头孢噻肟钠500mg/L的培养基上，脱苗后，转入到含Km6－8mg/L
的分化培养基上筛选，25天左右开始得抗性再生芽，转化率可达2.06%。
文中对影响大白菜外植体的高效再生和遗传转化的各种因素进行了讨论，为
进一步提高大白菜的再生频率和对金属硫蛋白的导入提供了参考意见，为转金属
硫蛋白基因打下了基础。
In this experiment, four varieties of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson, such as Tianjinqingmaye, Nanningzaoshu No.5, fifty days fast vegetable and Zhejiangzaoshu No.5 were use as material. The regeneration system of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson and an Agrobacterium-mediated genetic transformation system had been set up and some Gus transgenic plant of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson had been obtained successfully.
Factors effecting Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson explant regeneration were examined, which included the varieties, sterilant, sterilization time, soak seed time, plant hormones, ethylene inhibitor AgNO3, media basic components. A highly effective regeneration system was developed as follows: Seeds were soaked in 70% ethanol for 1 minute and surface-sterilized in 0.1% aqueous mercuric chloride solution for 12-15 minutes and washed for 3～4 time with sterilized water for 20-22 hours, then inoculated on MS basic medium or half of MS medium supplemented with GA 0.2mg/L to get the seedlings. After 6-8 days, the cotyledon explants were excised from seedlings and cultured under light on modified MS medium supplemented with NAA 0.3 mg/L, 6-13A4.0 mg/L and silver nitrate 4.0 mg/L. Shoots began to regenerate from explants after 2odays and the frequency of bud regeneration varied with different varieties. In this report, Tianjinqingmaye was 31.3%; Nanningzaoshu No.5 was 32%jifty days fast vegetable w
as 47.9% and Zhejiangzaoshu No.5 was 48.1%. The frequency of shoot regeneration from cotyledon explants of fifty days fast vegetable and Zhejiangzaoshu No.5 is higher. So both varieties were used as the material for transgenic experiment. Moreover, this experiment, by adopting the new potent cytokinin- Thidiazuran(TDZ) in the regeneration culture of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson firstly, which had raised the rate of differentiation by 169%; A good culture effect had been made.
-2-
This study performed Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson explants for genetic transformation by Agrobacterium-mediated genetic transformation. Some important factors affecting frequency of transformation including selection agent, culture condition of Agrobacterium tumefaciens, concentration of bacterial suspension, time of infection were examined. An Agrobacterium-mediated genetic transformation system of Brassica carnpestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson Zhejiangzaoshu No.5 and fifty days fast vegetable cotyledon explants was established as follows: Agrobacteriurn tumefaciens strains were isolated and cultured in liquid medium containing three kind of antibiotics (200rpm, 28 t) for about 22 hours then transformed them to YEB medium without any antibiotic. And then, they were cultured for 3-5 hours in the same conditions. UP to 0D6000.6, Cotyledon explants were incubated in diluted 1:10, Cotyledon explants which are excised from seven-day old seedlings were put into the Agrobacteriurn turn efa
ciens suspension and infected for 10 minutes. Infected explants were co-cultured for 2 days and transferred to selection medium containing 500 mg/L cefotaxime. After 25 days, resistibility shoots begin to occur and the frequency of transformation can reach 2.06%.
Finally, highly effective regeneration and genetic transformation system for Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson was discussed and made up with the suggest for further raising of the frequency of the regeneration and the transform for MT were made up. And therefore, the base of transgenic of MT had been made.
熟5号入手，从材料灭菌到大白菜转基因体系的建立，系统地研究了大白菜的再
生体系和根癌农杆菌介导的遗传转化体系，成功地获得了转GUS基因的大白菜植
株，并通过了鉴定。
通过对影响大白菜外植体再生的品种、灭菌剂、灭菌时间、浸种时间、植物
激素、乙烯抑制剂、培养基基本成分等诸多因素的对比试验，已建立起四个大白
菜品种的高效再生体系：种子先经70%乙醇处理1分钟，再用0.1%升汞溶液处理
12─15 分钟，进行表面灭菌；浸种20─22小时，然后接种在MS和
1/2MS＋GA0.2mg／L培养基上，获得无菌苗；取6─8天苗龄的无菌苗切下子叶外
植体，接种在附加NAA0.3mg／L＋6－BA4.0gm／L＋TDZ0.2mg／L＋AgNO34.0mg／L的
MS培养基上，进行光照培养。20天左右子叶外植体开始分化出芽。芽分化率因
品种不同而有差异，其中：天津青麻叶为31.3%；南宁早熟5号为32.0%；50天
快菜为47.9%；浙江早熟为48.1%。子叶外植体的芽分化率以50天快菜和浙江早
熟5号为高，故此以这两个品种作为转基因的试验材料。本试验还首次将新的高
活性细胞分裂素──TDZ引入大白菜再生培养中，芽分化率最高可提高169%，
取得了良好的培养效果。
农杆菌介导的植物遗传转化方法进行大白菜外植体的遗传转化。通
过对遗传转化过程中影响转化频率的筛选剂、根癌农杆菌生长状态、菌液浓度培
养时间等重要因素的研究，建立起以浙江早熟5号和50天快菜大白菜子叶为外植
体的一套可操作的遗传转化体系：挑单菌落接种根癌农杆菌菌株于三抗液体培养
基中，经28℃下200rpm振荡培养过夜，转接于不含抗生素的YEB培养基中，在
28℃培养3─5小时，OD600为0.6左右；取菌液稀释10倍，取7天苗龄的无菌苗，
切取子叶外植体；然后将子叶外植体浸泡侵染10分钟，吸干外植体上的菌液，共
培养两天后转入含头孢噻肟钠500mg/L的培养基上，脱苗后，转入到含Km6－8mg/L
的分化培养基上筛选，25天左右开始得抗性再生芽，转化率可达2.06%。
文中对影响大白菜外植体的高效再生和遗传转化的各种因素进行了讨论，为
进一步提高大白菜的再生频率和对金属硫蛋白的导入提供了参考意见，为转金属
硫蛋白基因打下了基础。
In this experiment, four varieties of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson, such as Tianjinqingmaye, Nanningzaoshu No.5, fifty days fast vegetable and Zhejiangzaoshu No.5 were use as material. The regeneration system of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson and an Agrobacterium-mediated genetic transformation system had been set up and some Gus transgenic plant of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson had been obtained successfully.
Factors effecting Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson explant regeneration were examined, which included the varieties, sterilant, sterilization time, soak seed time, plant hormones, ethylene inhibitor AgNO3, media basic components. A highly effective regeneration system was developed as follows: Seeds were soaked in 70% ethanol for 1 minute and surface-sterilized in 0.1% aqueous mercuric chloride solution for 12-15 minutes and washed for 3～4 time with sterilized water for 20-22 hours, then inoculated on MS basic medium or half of MS medium supplemented with GA 0.2mg/L to get the seedlings. After 6-8 days, the cotyledon explants were excised from seedlings and cultured under light on modified MS medium supplemented with NAA 0.3 mg/L, 6-13A4.0 mg/L and silver nitrate 4.0 mg/L. Shoots began to regenerate from explants after 2odays and the frequency of bud regeneration varied with different varieties. In this report, Tianjinqingmaye was 31.3%; Nanningzaoshu No.5 was 32%jifty days fast vegetable w
as 47.9% and Zhejiangzaoshu No.5 was 48.1%. The frequency of shoot regeneration from cotyledon explants of fifty days fast vegetable and Zhejiangzaoshu No.5 is higher. So both varieties were used as the material for transgenic experiment. Moreover, this experiment, by adopting the new potent cytokinin- Thidiazuran(TDZ) in the regeneration culture of Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson firstly, which had raised the rate of differentiation by 169%; A good culture effect had been made.
-2-
This study performed Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson explants for genetic transformation by Agrobacterium-mediated genetic transformation. Some important factors affecting frequency of transformation including selection agent, culture condition of Agrobacterium tumefaciens, concentration of bacterial suspension, time of infection were examined. An Agrobacterium-mediated genetic transformation system of Brassica carnpestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson Zhejiangzaoshu No.5 and fifty days fast vegetable cotyledon explants was established as follows: Agrobacteriurn tumefaciens strains were isolated and cultured in liquid medium containing three kind of antibiotics (200rpm, 28 t) for about 22 hours then transformed them to YEB medium without any antibiotic. And then, they were cultured for 3-5 hours in the same conditions. UP to 0D6000.6, Cotyledon explants were incubated in diluted 1:10, Cotyledon explants which are excised from seven-day old seedlings were put into the Agrobacteriurn turn efa
ciens suspension and infected for 10 minutes. Infected explants were co-cultured for 2 days and transferred to selection medium containing 500 mg/L cefotaxime. After 25 days, resistibility shoots begin to occur and the frequency of transformation can reach 2.06%.
Finally, highly effective regeneration and genetic transformation system for Brassica campestris ssp. Pekinensis (Lour) olsson was discussed and made up with the suggest for further raising of the frequency of the regeneration and the transform for MT were made up. And therefore, the base of transgenic of MT had been made.
引文
[1] 王国英，张宏，丁群星．几种玉米基因转移技术的研究及转基因植株的获得．生物工程学报，12(1)：45～49，1996．
[2] 叶健明，唐克轩，沈大棱．植物转基因方法概述．生命科学，Vol，11 NO．2．Apr：1999．
[3] Southgate E.M. Davey M R, Power J B, et al. Biotechnology Advances, 1995, 13:631—651.
[4] Gasser C S. Fraley R T. Science. 1989, 244: 1288—1299.
[5] Mariani C, De Beuckeer M, Truettner J, et al. Nature 1990, 347: 737—741.
[6] 李子银，胡会庆．农杆菌介导的植物遗传转化进展．《生物工程进展》，1998，Vol．18．NO．1：22—26，16．
[7] 唐惕．1990中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室，1989／1900年报，P11—12．
[8] 许耀．酚类化合物促进根癌农杆菌植物离体外植体的高效转化，科学通报，1988，22：1745—1748．
[9] 杨剑波．影响根癌农杆菌付着禾谷类作物培养细菌的因素，试验生物学报，1993，26(1)：1—7．
[10] 周音，张智奇，王少鸥等．十字花科植物基因技术研究进展及存在问题．吉林农业大学学报，1996，18(1)：96—102．
[11] 周延清，张根发，蒋达和等．农杆菌介导外源基因进入油菜的研究．河南师范大学学报(自然科学版)，1997 Vol25．No3．
[12] 石淑稳，周永明，孙学成等．甘蓝型油菜遗传转化体系的研究．华中农业大学学报，1998，Vol17．No．3．
[13] 刘凡，姚磊，李岩．利用大白菜小孢于胚壮体获得抗除草剂转基因植株．华北农学报，1998，13(4)：93—98．
[14] 周兴．酵母耐铜蛋白基因CUP_1，在大杨杆菌和毕赤酵母中的表达．广西大学硕士毕业论文，2000，
[15] 茹炳根，潘爱华，黄秉乾等．金属硫蛋白，生物化学与生物物理进展，1991，18(4)：254—259．
[16] Davey. M. R., et al., J. Exp. Bot 1991, 42: 1159—1169.
[17] 李宝健，吴敏．以改建的农杆菌Ti质粒转化外源基因用于单子叶植物花叶芽的研究，科学通报，1989，8：615
[18] 王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术，科学技术出版社．1998：229．
[19] 钟慧宏．亚蔬中心的耐热大白菜(J)．中国蔬菜，1990(4)：51—54．
[20] 贾士荣，曹冬孙．转基因植物(J)．植物学通报，1992，9(2)：3—15．
[21] Smith R H. Hood E E. Crop science. 1995, 35: 301—309.
[22] 华永刚．农杆菌介导的雪花莲疑集素基因转化大白菜的研究．浙江大学硕士学位论文．1999．
[23] 韦健琳，秦新民．大白菜组织培养．广西师范大学学报(自然科学版)．2000，Vol18，Nol．85—87．
[24] 侯喜林，曹寿椿．不结球白菜子叶离体培养再生植株．南京农业大学学报．1994，17(3)：60—64．
[25] 张鹏，凌定厚．提高菜心植株再生频率的研究，植物学报，1995，37(11)：902—908．
[26] 蔡小宁，余建明，侯喜林．不结球白菜下胚轴和子叶离体培养再生植株．江苏农业学报，1995，11(4)：51—54．
[27] 徐是雄，胡秀清，许霖庆．植物组织培养、外植体的形态发生和中药增效作用的研究，植物生理学报，1980，6：419—428．
[28] 李开莲，李耿光，张兰英．中国科学院华南植物研究所集刊，1990，60：81—86．
[29] 何勇强．酵母耐铜基因Cupi的克隆与耐铜转基因烟草(Nicotiaaa tabacum L．植株的培育．浙江大学博士学位论文．1999．
[30] 郭骁才，郑国，吴伯骥等．GUS基因转入烟草细胞通过科间细胞共培养在胡萝卜再生植株中的表达．山西农业科学，1995，23(4)：3—9
[31] JeffersonRA plant mol biolrep. 1987, 5:13 (2): 110—114.
[32] 蔡小宁，佘建明，朱桢，等．建立青菜农杆菌介导法基因转化体系．江苏农业学报，1997，13(2)：110—114．
[33] 张初贤，佘建明，蔡小宁，等．对小白菜和大白菜子叶诱导不定芽的影响．江苏农业研究，1999，30(4)：75—80
[34] 吴昌银，叶志彪，李汉霞，等．AgNO_3对不结球白菜子叶离体再生的影响．华中农业大学学报，Vol．18 No．1．Feb．1999，80—82．
[35] Palmiter, R. D., 1998, proc, Natl, Acad. Sci. USA 95: 8428—8430.
[36] Thornalley, P.J.& Vasak, M., 1985, Biochem. Bjopbys. Acta 827: 36—44.
[37] Min, K.S. Terano, y. Onosakas. etal, 1991, Toxicol. Appl, pharmacol. 148—157.
[38] 帖建科，李令嫒，茹炳根，等．金属硫蛋白清除自由基及其对自由基引起的核酸损伤保护作用的研究，生物物理学报，1995，11(2)：276—281．
[39] 程振东，卫志明，许智宏．根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生植物学报，1994，36(9)：657—663．
[40] 张松，魏毓棠，温孚红，等．利用乙烯抑制剂AgNO_3，建立大白菜高频植株再生体系，园艺学报，1997，24(1)：94—96．
[41] 蒋梁材，王瑞，蒲晓斌．现代生物技术在油菜育种中的应用，西南农业学报，vol．125，1999，12：40—46．
[42] 吴乃虎．基因工程原理(第二版)，科学出版社，北京
[43] 周延清．油莱组织培养，植物生理学通讯．1995，10：32—33．
[44] 周延清．转基因油菜研究进展，生物学通报．1994，29(5)：3—5．
[45] 徐华松，徐九龙，黄学林．TDZ在植物组织培养中的应用，广西植物，1996，6(1)：77—80．
[46] 周翼明，卫老明，许智宏等．PEG法介导转化诸葛菜下胚轴获得转基因植株．遗传学报，1996，23(1)：69—76
[47] 王芳琴，方宜钧．转基因植物发展现状．农业生物技术通讯，1998，4：4—6
[48] 王景雪，孙毅．农杆菌介导的植物基因转化研究进展．生物技术通报，1999，1：7—13
[49] 雷茂良，程金根．全球转基因植物发展现状．生物技术通报，1998，6：30—31
[50] 李洪清，李美茹．影响农杆菌介导植物基因转化的因素问题．植物生理学通报，1999，35(2)：145—151
[51] 莫华，冯雅君，崔克明等．转MT基因烟草对Cd~(2+)的耐受力及其细胞学研究．植物学报，1996，38(11)：875—880
[52] 周俊彦．THIDIAZURON的细胞分裂素活性研究．西北植物学报，1989，9(4)：203—211
[53] 王关林．高活性细胞激动素TDZ在植物组织培养中的应用．植物学通报，1997，14(3)：47—53
[54] 顾红雅，瞿礼嘉，明小天等．植物基因与分子操作．北京大学出版社，北京，1995
[55] 李有志．野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖产生有关的—基因族的鉴定和分析．华中农业大学博士学位论文．1998．
[56] Jefferson R.A, et al. Gus fusions: β—glucuronidase as a sensitive and uersative gene fusion marker in higher plants, 1987, EM BOJ 6:3901—3907
[57] 刘富．草莓转化体系的优化和保鲜基因工程的研究．沈阳农业大学硕士学位论文，1999
[58] Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtx, Freley RT. Sinence. 1985, 227:1229—1231
[59] 侯喜林．不同品种和激素条件对草莓花药培养的影响．南京农业大学，1992，15(2)：21—28
[60] Biale JB. Yong RE. Respirotion and ripening infruits-retrospect and prospect, Recent Advance in the Biochemistry of fruit and vegetables 1981, 1—39
[61] 余叔文，汤章城．(1998)植物生理与分子生物学(第二版)．科学出版社，
[62] 张保林，王文清，唐雯霞．(1993)金属硫蛋白清除氧自由基的机理．科学通报，38：1626—1628
[63] Clarkson TW(1983) Methylmercury toxicity to the mature and developing nervous system: possible mechanisms. In: Biological aspects of metals and metal-related diseases, ed. by Sarkar B. p183—197
[64] Scorza. R,Cordts, Mante S. Agrobacterium-mediated transformation of plum(Prunus domestica L.) With the papaya ringpot virus coat protein gene. Hortscience. 1991 26:786
[65] 刘世强．细胞工程的理论与实践．辽宁大学出版社．1994
[66] 科松．高活性细胞激动素TDZ在观赏植物“绿巨人”组织培养中的应用．广西大学硕士毕业论文．2000．
[67] 杨增海．园艺植物组织培养．农业出版社．1987．
[68] 崔凯荣，陈克明，王晓哲等．植物体细胞胚胎发生研究的某些现状．植物学通报．1993．10：14—20．
[69] Angeon G. EMBO Course on Plant Molecular Biology [M]. New York: Allerton Press, 1987.40—45.
[70] Quemada H, Hostis B L, Gonsalves D, et al. The nucleotide sequences of the 3'terminal regions of papaya ringspot virus strains W and P[J]. Journal of General Virology, 1990, 71: 203—210.
[71] Chi G L, Pua E C. Ethylene Inhibitors enhances.de nouo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp. Chinensis (Chinese cabbage) in uitro. Plant Sci, 1989.64:243—250
[72] Walton D C. Absciaic acid biosynthesis and metabolism. In: Davies P J ed., Plant Hormones and Their Role in Plant Growth Development. Dordrecht: Martinus Nijhof Publishers. 1987. 113—131
[73] Maret. W.& valee, B.L., proc. Natl. AcM. Sci. USA 1998, 95:3478—3482
[74] Uchida, Y., Takio. K., Titani, K.etal, Neuron. 1991, 7:3337—3347
[75] Lefebvre, D.D., Mikii, S.L., Laliberte, J.F., Bio/technol. 1987, 5:1053—1056
[76] 高煜珠，韩碧文，饶立华．植物生理学．农业出版社．1997.
[2] 叶健明，唐克轩，沈大棱．植物转基因方法概述．生命科学，Vol，11 NO．2．Apr：1999．
[3] Southgate E.M. Davey M R, Power J B, et al. Biotechnology Advances, 1995, 13:631—651.
[4] Gasser C S. Fraley R T. Science. 1989, 244: 1288—1299.
[5] Mariani C, De Beuckeer M, Truettner J, et al. Nature 1990, 347: 737—741.
[6] 李子银，胡会庆．农杆菌介导的植物遗传转化进展．《生物工程进展》，1998，Vol．18．NO．1：22—26，16．
[7] 唐惕．1990中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室，1989／1900年报，P11—12．
[8] 许耀．酚类化合物促进根癌农杆菌植物离体外植体的高效转化，科学通报，1988，22：1745—1748．
[9] 杨剑波．影响根癌农杆菌付着禾谷类作物培养细菌的因素，试验生物学报，1993，26(1)：1—7．
[10] 周音，张智奇，王少鸥等．十字花科植物基因技术研究进展及存在问题．吉林农业大学学报，1996，18(1)：96—102．
[11] 周延清，张根发，蒋达和等．农杆菌介导外源基因进入油菜的研究．河南师范大学学报(自然科学版)，1997 Vol25．No3．
[12] 石淑稳，周永明，孙学成等．甘蓝型油菜遗传转化体系的研究．华中农业大学学报，1998，Vol17．No．3．
[13] 刘凡，姚磊，李岩．利用大白菜小孢于胚壮体获得抗除草剂转基因植株．华北农学报，1998，13(4)：93—98．
[14] 周兴．酵母耐铜蛋白基因CUP_1，在大杨杆菌和毕赤酵母中的表达．广西大学硕士毕业论文，2000，
[15] 茹炳根，潘爱华，黄秉乾等．金属硫蛋白，生物化学与生物物理进展，1991，18(4)：254—259．
[16] Davey. M. R., et al., J. Exp. Bot 1991, 42: 1159—1169.
[17] 李宝健，吴敏．以改建的农杆菌Ti质粒转化外源基因用于单子叶植物花叶芽的研究，科学通报，1989，8：615
[18] 王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术，科学技术出版社．1998：229．
[19] 钟慧宏．亚蔬中心的耐热大白菜(J)．中国蔬菜，1990(4)：51—54．
[20] 贾士荣，曹冬孙．转基因植物(J)．植物学通报，1992，9(2)：3—15．
[21] Smith R H. Hood E E. Crop science. 1995, 35: 301—309.
[22] 华永刚．农杆菌介导的雪花莲疑集素基因转化大白菜的研究．浙江大学硕士学位论文．1999．
[23] 韦健琳，秦新民．大白菜组织培养．广西师范大学学报(自然科学版)．2000，Vol18，Nol．85—87．
[24] 侯喜林，曹寿椿．不结球白菜子叶离体培养再生植株．南京农业大学学报．1994，17(3)：60—64．
[25] 张鹏，凌定厚．提高菜心植株再生频率的研究，植物学报，1995，37(11)：902—908．
[26] 蔡小宁，余建明，侯喜林．不结球白菜下胚轴和子叶离体培养再生植株．江苏农业学报，1995，11(4)：51—54．
[27] 徐是雄，胡秀清，许霖庆．植物组织培养、外植体的形态发生和中药增效作用的研究，植物生理学报，1980，6：419—428．
[28] 李开莲，李耿光，张兰英．中国科学院华南植物研究所集刊，1990，60：81—86．
[29] 何勇强．酵母耐铜基因Cupi的克隆与耐铜转基因烟草(Nicotiaaa tabacum L．植株的培育．浙江大学博士学位论文．1999．
[30] 郭骁才，郑国，吴伯骥等．GUS基因转入烟草细胞通过科间细胞共培养在胡萝卜再生植株中的表达．山西农业科学，1995，23(4)：3—9
[31] JeffersonRA plant mol biolrep. 1987, 5:13 (2): 110—114.
[32] 蔡小宁，佘建明，朱桢，等．建立青菜农杆菌介导法基因转化体系．江苏农业学报，1997，13(2)：110—114．
[33] 张初贤，佘建明，蔡小宁，等．对小白菜和大白菜子叶诱导不定芽的影响．江苏农业研究，1999，30(4)：75—80
[34] 吴昌银，叶志彪，李汉霞，等．AgNO_3对不结球白菜子叶离体再生的影响．华中农业大学学报，Vol．18 No．1．Feb．1999，80—82．
[35] Palmiter, R. D., 1998, proc, Natl, Acad. Sci. USA 95: 8428—8430.
[36] Thornalley, P.J.& Vasak, M., 1985, Biochem. Bjopbys. Acta 827: 36—44.
[37] Min, K.S. Terano, y. Onosakas. etal, 1991, Toxicol. Appl, pharmacol. 148—157.
[38] 帖建科，李令嫒，茹炳根，等．金属硫蛋白清除自由基及其对自由基引起的核酸损伤保护作用的研究，生物物理学报，1995，11(2)：276—281．
[39] 程振东，卫志明，许智宏．根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生植物学报，1994，36(9)：657—663．
[40] 张松，魏毓棠，温孚红，等．利用乙烯抑制剂AgNO_3，建立大白菜高频植株再生体系，园艺学报，1997，24(1)：94—96．
[41] 蒋梁材，王瑞，蒲晓斌．现代生物技术在油菜育种中的应用，西南农业学报，vol．125，1999，12：40—46．
[42] 吴乃虎．基因工程原理(第二版)，科学出版社，北京
[43] 周延清．油莱组织培养，植物生理学通讯．1995，10：32—33．
[44] 周延清．转基因油菜研究进展，生物学通报．1994，29(5)：3—5．
[45] 徐华松，徐九龙，黄学林．TDZ在植物组织培养中的应用，广西植物，1996，6(1)：77—80．
[46] 周翼明，卫老明，许智宏等．PEG法介导转化诸葛菜下胚轴获得转基因植株．遗传学报，1996，23(1)：69—76
[47] 王芳琴，方宜钧．转基因植物发展现状．农业生物技术通讯，1998，4：4—6
[48] 王景雪，孙毅．农杆菌介导的植物基因转化研究进展．生物技术通报，1999，1：7—13
[49] 雷茂良，程金根．全球转基因植物发展现状．生物技术通报，1998，6：30—31
[50] 李洪清，李美茹．影响农杆菌介导植物基因转化的因素问题．植物生理学通报，1999，35(2)：145—151
[51] 莫华，冯雅君，崔克明等．转MT基因烟草对Cd~(2+)的耐受力及其细胞学研究．植物学报，1996，38(11)：875—880
[52] 周俊彦．THIDIAZURON的细胞分裂素活性研究．西北植物学报，1989，9(4)：203—211
[53] 王关林．高活性细胞激动素TDZ在植物组织培养中的应用．植物学通报，1997，14(3)：47—53
[54] 顾红雅，瞿礼嘉，明小天等．植物基因与分子操作．北京大学出版社，北京，1995
[55] 李有志．野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖产生有关的—基因族的鉴定和分析．华中农业大学博士学位论文．1998．
[56] Jefferson R.A, et al. Gus fusions: β—glucuronidase as a sensitive and uersative gene fusion marker in higher plants, 1987, EM BOJ 6:3901—3907
[57] 刘富．草莓转化体系的优化和保鲜基因工程的研究．沈阳农业大学硕士学位论文，1999
[58] Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtx, Freley RT. Sinence. 1985, 227:1229—1231
[59] 侯喜林．不同品种和激素条件对草莓花药培养的影响．南京农业大学，1992，15(2)：21—28
[60] Biale JB. Yong RE. Respirotion and ripening infruits-retrospect and prospect, Recent Advance in the Biochemistry of fruit and vegetables 1981, 1—39
[61] 余叔文，汤章城．(1998)植物生理与分子生物学(第二版)．科学出版社，
[62] 张保林，王文清，唐雯霞．(1993)金属硫蛋白清除氧自由基的机理．科学通报，38：1626—1628
[63] Clarkson TW(1983) Methylmercury toxicity to the mature and developing nervous system: possible mechanisms. In: Biological aspects of metals and metal-related diseases, ed. by Sarkar B. p183—197
[64] Scorza. R,Cordts, Mante S. Agrobacterium-mediated transformation of plum(Prunus domestica L.) With the papaya ringpot virus coat protein gene. Hortscience. 1991 26:786
[65] 刘世强．细胞工程的理论与实践．辽宁大学出版社．1994
[66] 科松．高活性细胞激动素TDZ在观赏植物“绿巨人”组织培养中的应用．广西大学硕士毕业论文．2000．
[67] 杨增海．园艺植物组织培养．农业出版社．1987．
[68] 崔凯荣，陈克明，王晓哲等．植物体细胞胚胎发生研究的某些现状．植物学通报．1993．10：14—20．
[69] Angeon G. EMBO Course on Plant Molecular Biology [M]. New York: Allerton Press, 1987.40—45.
[70] Quemada H, Hostis B L, Gonsalves D, et al. The nucleotide sequences of the 3'terminal regions of papaya ringspot virus strains W and P[J]. Journal of General Virology, 1990, 71: 203—210.
[71] Chi G L, Pua E C. Ethylene Inhibitors enhances.de nouo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp. Chinensis (Chinese cabbage) in uitro. Plant Sci, 1989.64:243—250
[72] Walton D C. Absciaic acid biosynthesis and metabolism. In: Davies P J ed., Plant Hormones and Their Role in Plant Growth Development. Dordrecht: Martinus Nijhof Publishers. 1987. 113—131
[73] Maret. W.& valee, B.L., proc. Natl. AcM. Sci. USA 1998, 95:3478—3482
[74] Uchida, Y., Takio. K., Titani, K.etal, Neuron. 1991, 7:3337—3347
[75] Lefebvre, D.D., Mikii, S.L., Laliberte, J.F., Bio/technol. 1987, 5:1053—1056
[76] 高煜珠，韩碧文，饶立华．植物生理学．农业出版社．1997.