蒜头果组织培养体系的建立及细胞悬浮培养技术研究
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摘要
蒜头果(Malania oleifera)是我国特有的单种属植物。蒜头果种子富含油脂，其中二十四碳-15-烯酸是合成麝香酮(muscone)的理想原料，具有较大的开发价值。本课题的研究为蒜头果组培苗的工厂化生产和利用愈伤组织或悬浮细胞进行工业化发酵生产二十四碳—15—烯酸的应用提供理论依据。
本文对蒜头果无菌苗诱导、芽的直接诱导、茎段和下胚轴愈伤组织诱导及分化、生根壮苗、炼苗与移栽、胚乳愈伤组织的诱导与增殖、胚乳愈伤组织的细胞悬浮培养等方面进行了研究。试验结果如下：
①8月是蒜头果播种苗茎段取材的最适合季节，此时启动率高，为80.00％，同时污染率低，为36.67％。播种苗茎段的最佳消毒组合是75％乙醇10S+10％NaClO10min+0.1％HgCl_2 8min；蒜头果种仁的最佳消毒组合是75％乙醇10S+12％NaClO10min+0.1％HgCl_2 30min。
②适宜蒜头果种胚无菌苗的诱导的最佳配方为：MS+NAA0.2mg／L。
③蒜头果种胚无菌苗的各部位以及实生苗带芽茎段都能直接诱导芽，其中带子叶腋芽茎段是较好的用于芽诱导的材料，其最佳试验配方为：MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT1.0mg／L。而无项芽茎段最佳试验配方为：MS+NAA0.2+KT1.0mg／L；下胚轴最佳试验配方为：MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT0.5mg／L；实生苗带芽茎段的最佳试验配方为：MS+NAA0.1+KT1.0mg／L。
④最适宜下胚轴诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.4+KT0.2mg／L；最适宜茎段诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.2+KT0.2mg／L。通过茎段诱导得到的愈伤组织不能分化成苗；下胚轴愈伤组织诱导分化的最适培养基为MS+NAA0.2+ZT3.0+KT2.0mg／L，但也只有极少数转为嫩绿色愈伤组织可分化出芽，并且芽长势不佳，最终很难成活下来。
⑤进行健壮无菌苗的生根诱导时，采用间歇光照培养，发现无菌苗在培养10d后基部有膨大现象，继而有少量愈伤组织出现，60d后有少量细小根发生。
⑥适宜蒜头果无菌苗移栽的基质是河沙，移栽成活率可达80.00％。
⑦适宜蒜头果胚乳愈伤组织诱导的基本培养基为MS培养基。5个植株号的诱导率及最佳诱导配方存在差异。在一定浓度范围内，高浓度的2，4-D与低浓度的6-BA具有协同作用，能有效的促进胚乳愈伤组织的诱导及增殖，适宜浓度的KT和GA_3可以促进愈伤组织的生长。添加甘氨酸虽然能提高胚乳愈伤组织诱导率，但其诱导的愈伤组织不适宜用于液体悬浮培养，椰乳则对胚乳愈伤组织的诱导有抑制作用。胚乳愈伤组织最佳增殖培养基为：MS+2，4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg／L。
⑧适宜胚乳愈伤组织悬浮培养的条件为：最佳基本培养基是MS；最佳激素配组：2，4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg／L；最佳的初始接种浓度是每100ml培养液中接种4g；最适pH是5.8；最佳的培养温度为28℃；最佳蔗糖浓度为40g／L。
⑨胚乳、胚乳愈伤组织、悬浮培养液的二十四碳—15—烯酸含量分别为31％、11.3％、2.9g／L。
Malania oleifera is a peculiar single-species and single-category plant in ourcountry. Its seed has abound oil, among which, z-15-tetracosenoic acid is considered tobe the ideal raw materials of muscone synthesizes, so Malania oleifera has quite greatvalue on exploitation and utilization. The study offer theoretical foundation for industrialmanufacture of tissue-cultured plants and for the producing z-15-tetracosenoic acid bycallus and suspension cell.
This paper studies comprehensively on the induction of aseptic seedlings, theimmediate induction of bud, callus induction and differentiation from stems andhypocotyls, rooting and transplanting of tissue culture shoots, callus induction andmultiplication from albumen and the cell suspension culture etc. ofMalania oleifera. Thepreliminary experiments' results as follows:
①August is considered to be the best season to draw materials, in which thegermination rate is 80.00%, and the contaminated rate is only 36.67%. The suitabledisinfection method of seeding plant's stem is 75%ethanol 10S+10%NaClO10min+0.1%HgCl_28min. The suitable disinfection method of kernel is 75%ethanol10S+10%NaClO10min+0.1% HgCl_230min.
②The optimum recipe of the induction of aseptic seedlings from embryo isMS+NAA0.2mg/L.
③Every part of aseptic seedling from embryo and the stem with bud of seedlingscan immediately induct bud, among which, the best material is stem with cotyledonsaxillary bud, of which the optimum recipe is MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT1.0mg/L. Theoptimum recipe of stem without top-bud, hypocotyls and stem with bud of seedlings are MS+NAA0.2+KT1.0mg/L, MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT0.5mg/L and MS+NAA0.1+KT1.0mg/L respectively.
④The optimum recipe of callus induction of hypocotyls and stem areMS+2, 4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.4+KT0.2mg/L and MS+2, 4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.2+KT0.2mg/L respectively. The callus induced from stem can't differentiate. Theoptimum recipe of differentiation from hypocotyl's callus is MS+NAA0.2+ZT3.0+KT2.0mg/L. However, just a little of peak green callus can differentiate, and the growthof bud is so thin that can't survive.
⑤The bottom of aseptic seedlings becomes expanded after 10 days, and then a littleof callus appears, and thin-root is produced after 60 days, The inducing of root byintermittent illumination.
⑥The best transplant medium is sand, which the rate of survival is 80.00%.
⑦MS is considered to be the best basic medium for callus induction from albumen.The induction rate and the optimum recipe of different plant is varied. In givenconsistency, 2, 4-D with high consistency coorperated with 6-BA with low consistencycan promote efficaciously the induction and propagation of calli. KT and GA_3 withsuitable consistency can promote the growth of calli, Added with glycin can enhance therate of induction, but the callus is ill-fitted to the cell suspension culture. CM is inhibitingfor callus induction from albumen. The optimum recipes of callus multiplication isMS+2, 4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg/L.
⑧The suitable culture condition are following: the basic medium is MS, thehormone combination is 2, 4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg/L, the initial inoculationconcentration is 4g/100ml, the pH value is 5.8, the culture temperature is 28℃and thesucrose concentration is 40g/L.
⑨The content of z-15-tetracosenoic acid in albumen、callus induction from albumenand suspended solids are following: 31%, 11.3% and 2.9 g/L.
本文对蒜头果无菌苗诱导、芽的直接诱导、茎段和下胚轴愈伤组织诱导及分化、生根壮苗、炼苗与移栽、胚乳愈伤组织的诱导与增殖、胚乳愈伤组织的细胞悬浮培养等方面进行了研究。试验结果如下：
①8月是蒜头果播种苗茎段取材的最适合季节，此时启动率高，为80.00％，同时污染率低，为36.67％。播种苗茎段的最佳消毒组合是75％乙醇10S+10％NaClO10min+0.1％HgCl_2 8min；蒜头果种仁的最佳消毒组合是75％乙醇10S+12％NaClO10min+0.1％HgCl_2 30min。
②适宜蒜头果种胚无菌苗的诱导的最佳配方为：MS+NAA0.2mg／L。
③蒜头果种胚无菌苗的各部位以及实生苗带芽茎段都能直接诱导芽，其中带子叶腋芽茎段是较好的用于芽诱导的材料，其最佳试验配方为：MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT1.0mg／L。而无项芽茎段最佳试验配方为：MS+NAA0.2+KT1.0mg／L；下胚轴最佳试验配方为：MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT0.5mg／L；实生苗带芽茎段的最佳试验配方为：MS+NAA0.1+KT1.0mg／L。
④最适宜下胚轴诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.4+KT0.2mg／L；最适宜茎段诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.2+KT0.2mg／L。通过茎段诱导得到的愈伤组织不能分化成苗；下胚轴愈伤组织诱导分化的最适培养基为MS+NAA0.2+ZT3.0+KT2.0mg／L，但也只有极少数转为嫩绿色愈伤组织可分化出芽，并且芽长势不佳，最终很难成活下来。
⑤进行健壮无菌苗的生根诱导时，采用间歇光照培养，发现无菌苗在培养10d后基部有膨大现象，继而有少量愈伤组织出现，60d后有少量细小根发生。
⑥适宜蒜头果无菌苗移栽的基质是河沙，移栽成活率可达80.00％。
⑦适宜蒜头果胚乳愈伤组织诱导的基本培养基为MS培养基。5个植株号的诱导率及最佳诱导配方存在差异。在一定浓度范围内，高浓度的2，4-D与低浓度的6-BA具有协同作用，能有效的促进胚乳愈伤组织的诱导及增殖，适宜浓度的KT和GA_3可以促进愈伤组织的生长。添加甘氨酸虽然能提高胚乳愈伤组织诱导率，但其诱导的愈伤组织不适宜用于液体悬浮培养，椰乳则对胚乳愈伤组织的诱导有抑制作用。胚乳愈伤组织最佳增殖培养基为：MS+2，4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg／L。
⑧适宜胚乳愈伤组织悬浮培养的条件为：最佳基本培养基是MS；最佳激素配组：2，4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg／L；最佳的初始接种浓度是每100ml培养液中接种4g；最适pH是5.8；最佳的培养温度为28℃；最佳蔗糖浓度为40g／L。
⑨胚乳、胚乳愈伤组织、悬浮培养液的二十四碳—15—烯酸含量分别为31％、11.3％、2.9g／L。
Malania oleifera is a peculiar single-species and single-category plant in ourcountry. Its seed has abound oil, among which, z-15-tetracosenoic acid is considered tobe the ideal raw materials of muscone synthesizes, so Malania oleifera has quite greatvalue on exploitation and utilization. The study offer theoretical foundation for industrialmanufacture of tissue-cultured plants and for the producing z-15-tetracosenoic acid bycallus and suspension cell.
This paper studies comprehensively on the induction of aseptic seedlings, theimmediate induction of bud, callus induction and differentiation from stems andhypocotyls, rooting and transplanting of tissue culture shoots, callus induction andmultiplication from albumen and the cell suspension culture etc. ofMalania oleifera. Thepreliminary experiments' results as follows:
①August is considered to be the best season to draw materials, in which thegermination rate is 80.00%, and the contaminated rate is only 36.67%. The suitabledisinfection method of seeding plant's stem is 75%ethanol 10S+10%NaClO10min+0.1%HgCl_28min. The suitable disinfection method of kernel is 75%ethanol10S+10%NaClO10min+0.1% HgCl_230min.
②The optimum recipe of the induction of aseptic seedlings from embryo isMS+NAA0.2mg/L.
③Every part of aseptic seedling from embryo and the stem with bud of seedlingscan immediately induct bud, among which, the best material is stem with cotyledonsaxillary bud, of which the optimum recipe is MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT1.0mg/L. Theoptimum recipe of stem without top-bud, hypocotyls and stem with bud of seedlings are MS+NAA0.2+KT1.0mg/L, MS+NAA0.1+6-BA1.0+KT0.5mg/L and MS+NAA0.1+KT1.0mg/L respectively.
④The optimum recipe of callus induction of hypocotyls and stem areMS+2, 4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.4+KT0.2mg/L and MS+2, 4-D2.0+NAA1.0+6-BA0.2+KT0.2mg/L respectively. The callus induced from stem can't differentiate. Theoptimum recipe of differentiation from hypocotyl's callus is MS+NAA0.2+ZT3.0+KT2.0mg/L. However, just a little of peak green callus can differentiate, and the growthof bud is so thin that can't survive.
⑤The bottom of aseptic seedlings becomes expanded after 10 days, and then a littleof callus appears, and thin-root is produced after 60 days, The inducing of root byintermittent illumination.
⑥The best transplant medium is sand, which the rate of survival is 80.00%.
⑦MS is considered to be the best basic medium for callus induction from albumen.The induction rate and the optimum recipe of different plant is varied. In givenconsistency, 2, 4-D with high consistency coorperated with 6-BA with low consistencycan promote efficaciously the induction and propagation of calli. KT and GA_3 withsuitable consistency can promote the growth of calli, Added with glycin can enhance therate of induction, but the callus is ill-fitted to the cell suspension culture. CM is inhibitingfor callus induction from albumen. The optimum recipes of callus multiplication isMS+2, 4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg/L.
⑧The suitable culture condition are following: the basic medium is MS, thehormone combination is 2, 4-D2.0+6-BA0.2+GA_30.4mg/L, the initial inoculationconcentration is 4g/100ml, the pH value is 5.8, the culture temperature is 28℃and thesucrose concentration is 40g/L.
⑨The content of z-15-tetracosenoic acid in albumen、callus induction from albumenand suspended solids are following: 31%, 11.3% and 2.9 g/L.
引文
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