茶多糖分离纯化及理化性质的研究
摘要
茶多糖(Tea polysaccharide)是茶叶中的重要的生物活性成分，具有许多特殊的生理功能。但是它的分离纯化却一直是个亟待解决的问题，而且茶多糖的含量与组成会随着提取方法和工艺的不同而有很大的差异。
本论文是以重庆雅安茶厂生产的康砖为原料，通过几种不同提取工艺的比较来选择出一种适合工业化大生产的成本低廉，步骤简单，产量较高的TPS提取纯化新流程。并通过实验确定此流程中一些重要参数的配比以得到最佳的提取效果。
超滤法是一种较为理想的工业化提取TPS的工艺，其加入无水乙醇、去离子水、提取温度及时间等的最佳比例分别为2倍、1：4、60℃和3.5h。利用Sevag脱蛋白，加入1/4体积的氯仿和1/16体积的正丁醇，氯仿使蛋白质变性，变性的蛋白质溶于正丁醇中，而多糖不溶于有机层，则可将蛋白质除去。但是蛋白质减少的同时多糖类也在减少，而且Sevag法脱蛋白主要集中在前3次，其所占比例可达90％以上。另外，氯仿是有毒物质，容易造成多糖活性的下降和溶剂的沉积。因此，从成本的低廉和环境的清洁考虑，Sevag脱蛋白3次较适宜。
超滤法提取操作条件温和，不会引起多糖的降解，而且设备简单，操作方便，没有相的转移。但是膜的选择和压力的调试也比较重要。通过试验确定了截留分子量为10000d的超滤膜在0.2MPa的压力下进行为宜。
通过纸层析及其组分的研究，可以确定TPS是由多糖类、蛋白质、灰分、水分及其它成分所组成，而且蛋白质含量较高，猜测其与多糖呈紧密结合态，因此所得到的TPS可能是一种蛋白多糖。
超滤法提取的TPS在沸水中有较好的溶解性，但不溶于高浓度的有机溶剂中。而且其热稳定性较差，在高温或过酸和偏碱的情况下，均会使其中的多糖部分水解而造成损失。
利用纸层析和气相色谱分析TPS的单糖组成，发现它是由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成。纸层析与气相色谱分析的结果接近，只是由于半乳糖醛酸极性大，不易气化而未能出峰，其摩尔比例为，Ara：Man：Gal：Glc=8.24：3.38：23.82：24.56，它们的平均分子量为95000。
Tea polysaccharide is a kind of important active composition of tea which has many special physiological functions. But the purification of TPS is very hard and the composition and yield of TPS will vary with the technology of purification.
A sort of technology of isolating and purifying TPS which adapts to industrialization will be opted from four kinds of technology that is low-cost, simple-process and high-yield. And this technology will be tested to determine the best technical parameter.
Ultra-filtrate is a sort of unearthly industrialization technology and the best ratio of alcohol volume ,distilled water, temperature, time are 2 doubles, 1:4, 60 , and 3.5h. Sevag deprotein should plus 1/4 chloroform and 1/16 butyalcohol. Chloroform can denaturalize protein and make it dissolve in butyalcohol which may wipe off protein because TPS don't dissolve in it But as the reduce of protein, TPS also will decrease and the mostly effect of Sevag deprotein operates in former 3 times which accounts for 90 percent. In addition, chloroform is venomousness which can descend activity of TPS and enhance deposition of impregnant So, taking into account of cost and entironment, Sevag deprotein is carried through 3 tunes.
The manipulation condition of ultra-filtrate is moderation mat won't decompose TPS and It has briefness equipment, simple operation and unshift substance. But choose of velum and pressure are crucial. Through examination, molecular weight of block suits to 10000dal and the pressure is 0.2MPa.
TPS consists of polysaccharide, protein, water, ash and others by paper chromatography,
and the research of ingredient. The content of protein is rather high. Protein maybe links to polysaccharide compact. So, TPS probably is a kind of protein-polysaccharide.
TPS with ultra-filtrate can dissolve in boiling-water but not in organic impregnant. Polysaccharide of TPS will decompound in high temperature, strong-acid and intensity-alkali.
By paper chromatography and gas chromatography analyses, their compositions of monosaccharides were gained: Ara, Man, Glc, Gal and Gal-aid. The Gal-aid can't be determined In paper chromatography because of it's polarity. Their molecular ratio is Ara: Man: Gal: Glc - 8.24: 3,38: 23.82: 24.56 and their mean molecular weight is 95000.
本论文是以重庆雅安茶厂生产的康砖为原料，通过几种不同提取工艺的比较来选择出一种适合工业化大生产的成本低廉，步骤简单，产量较高的TPS提取纯化新流程。并通过实验确定此流程中一些重要参数的配比以得到最佳的提取效果。
超滤法是一种较为理想的工业化提取TPS的工艺，其加入无水乙醇、去离子水、提取温度及时间等的最佳比例分别为2倍、1：4、60℃和3.5h。利用Sevag脱蛋白，加入1/4体积的氯仿和1/16体积的正丁醇，氯仿使蛋白质变性，变性的蛋白质溶于正丁醇中，而多糖不溶于有机层，则可将蛋白质除去。但是蛋白质减少的同时多糖类也在减少，而且Sevag法脱蛋白主要集中在前3次，其所占比例可达90％以上。另外，氯仿是有毒物质，容易造成多糖活性的下降和溶剂的沉积。因此，从成本的低廉和环境的清洁考虑，Sevag脱蛋白3次较适宜。
超滤法提取操作条件温和，不会引起多糖的降解，而且设备简单，操作方便，没有相的转移。但是膜的选择和压力的调试也比较重要。通过试验确定了截留分子量为10000d的超滤膜在0.2MPa的压力下进行为宜。
通过纸层析及其组分的研究，可以确定TPS是由多糖类、蛋白质、灰分、水分及其它成分所组成，而且蛋白质含量较高，猜测其与多糖呈紧密结合态，因此所得到的TPS可能是一种蛋白多糖。
超滤法提取的TPS在沸水中有较好的溶解性，但不溶于高浓度的有机溶剂中。而且其热稳定性较差，在高温或过酸和偏碱的情况下，均会使其中的多糖部分水解而造成损失。
利用纸层析和气相色谱分析TPS的单糖组成，发现它是由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成。纸层析与气相色谱分析的结果接近，只是由于半乳糖醛酸极性大，不易气化而未能出峰，其摩尔比例为，Ara：Man：Gal：Glc=8.24：3.38：23.82：24.56，它们的平均分子量为95000。
Tea polysaccharide is a kind of important active composition of tea which has many special physiological functions. But the purification of TPS is very hard and the composition and yield of TPS will vary with the technology of purification.
A sort of technology of isolating and purifying TPS which adapts to industrialization will be opted from four kinds of technology that is low-cost, simple-process and high-yield. And this technology will be tested to determine the best technical parameter.
Ultra-filtrate is a sort of unearthly industrialization technology and the best ratio of alcohol volume ,distilled water, temperature, time are 2 doubles, 1:4, 60 , and 3.5h. Sevag deprotein should plus 1/4 chloroform and 1/16 butyalcohol. Chloroform can denaturalize protein and make it dissolve in butyalcohol which may wipe off protein because TPS don't dissolve in it But as the reduce of protein, TPS also will decrease and the mostly effect of Sevag deprotein operates in former 3 times which accounts for 90 percent. In addition, chloroform is venomousness which can descend activity of TPS and enhance deposition of impregnant So, taking into account of cost and entironment, Sevag deprotein is carried through 3 tunes.
The manipulation condition of ultra-filtrate is moderation mat won't decompose TPS and It has briefness equipment, simple operation and unshift substance. But choose of velum and pressure are crucial. Through examination, molecular weight of block suits to 10000dal and the pressure is 0.2MPa.
TPS consists of polysaccharide, protein, water, ash and others by paper chromatography,
and the research of ingredient. The content of protein is rather high. Protein maybe links to polysaccharide compact. So, TPS probably is a kind of protein-polysaccharide.
TPS with ultra-filtrate can dissolve in boiling-water but not in organic impregnant. Polysaccharide of TPS will decompound in high temperature, strong-acid and intensity-alkali.
By paper chromatography and gas chromatography analyses, their compositions of monosaccharides were gained: Ara, Man, Glc, Gal and Gal-aid. The Gal-aid can't be determined In paper chromatography because of it's polarity. Their molecular ratio is Ara: Man: Gal: Glc - 8.24: 3,38: 23.82: 24.56 and their mean molecular weight is 95000.
引文
1．陈宗道主编．茶叶化学工程学．西南师范大学出版社．1999
2. Masayuki Suzuki et al. Characteristic distribution of 2-O-(β-L-Arabinopyranosyl)-Myo-Inositol in tea plant (Camellia sinonsis), Proceedings of the International Symposium on Tea science, Japan, 1991. 135～139
3．陈宗道等．微生物与普洱茶发酵．茶叶科技，1985(4)：4-7
4．汪东风等．茶叶多糖及其药理作用进展．天然药物研究与开发，1996(3)：63～67
5. Wang dongfeng et al. Study of pharmaceutical components in coarse tea on curing diabetes. Proceedings of the '95 International Tea-Quality-Human Health Symposium,china, 1995.84～86
6．黄桂宪等．广西绿茶多糖的分离与分析．中国茶叶，1995(5)：18～19
7．汪东风等．粗老茶中的多糖含量及其保健作用．茶叶科学，1994，14(1)：73～74
8．萧伟祥等．茶多糖生物活性与结构的研究进展．中国茶叶，2002，24(1)：14～15
9．张惟杰．糖复合物生化研究技术．浙江大学出版社．1999
10．朱秋军．香菇多糖的分离纯化及理化性质的研究．华中农业大学硕士论文，1998
11．张龙翔等．生化实验方法和技术．人民教育出版社，1981
12．屠幼英．绿茶饮料中茶多糖的构成．茶叶，2001，27(2)：22～24
13．赵国华．四种根茎类食物活性多糖的研究．西南农业大学博士论文，2001
14. Ito En Co, Ltd, Rido Chemical Co. Ltd. (Takeo C, kinugasa H), Oosu H),JP04,124,139, Chemical Abstrats, 1992, 117(8):76468
15．叶盛等．茶叶多糖及其生物活性．茶叶科学技术，2001(1)：8～11
16．安徽农业大学主编．茶叶生物化学(第二版)．北京：农业出版社，1988
17．王淑如等．茶叶多糖的抗凝血及抗血栓作用．中草药，1992，23(5)：254～256
18．汪东风等．粗老茶治疗糖尿病的药理成分分析．中草药，1995，26(5)：255～257
19．王丁刚等．茶叶多糖的降血糖、抗炎及碳廓清作用．茶叶科学，1991，11(2)：173～174
20. Kenichi E, Tokuro T, Tadakazu T. Proceedings of the International Symposium on Tea Science, 1991,8,26～29, Shizuoka Japan/The Organizing Committee of ISTS, 1992,240～242
21. Reed Chemical K K(Mori M, Morita N, Ikeoaya K). JP 63,308,001,Chemical Abstracts, 1989,111:140472
22．王丁刚，王淑如．茶叶多糖的分离、纯化、分析及降血脂作用．中国药科大学学报，
1991，22(4)：225～228
23．楼福庆等．茶叶与动脉粥样硬化．浙江医学，1981，3(4)：5
24．肖慧等．茶多糖的提取与纯化研究．茶业通报，1993，11(4)：5～6
25．涂茂兵．香菇多糖的提取工艺的优化研究．天津轻工学院硕士论文，1995
26．方积年等．香菇多糖的分离纯化方法．专利，1995
27．崔福生等．医学生化检验手册．天津科学技术出版社，1982
28．中国农业科学院茶叶研究所主编．茶树生理及茶叶生化实验手册．农业出版社，1983
29．程启坤主编．茶化浅析．中国农科院茶叶研究所资料研究室，1982
30．张俐娜等．动态膜渗透压法测定生漆多糖水溶液．高分子学报，1989(3)：370～373
31．倪德江等．脱蛋白工艺对茶多糖提取率及蛋白质含量德影响．中国茶叶，2002，24(4)：6～7
32．汪东风等．茶多糖等有效成分综合提取．中草药，1998，29(11)：739～740
33．王玉琦等．分子活化法分析研究多功能铁芒萁叶中稀土结合多糖．中国科学，1997，27(6)：64～68
34．邓俊林等．茶叶多糖的分离，纯化及分析．重庆师范学院学报，1998，15(2)：37～38
35. Treveluan WE and Harrison JS. Studies on yeast metabolism biochem J 1952,50:298
36. Nelly Blumenkrantz and Gustav Asboe-hansen. New method for uronic acids. Anal biochem 1973,54:484
37．魏远安等．高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量．药学学报，1989，24(7)：532～536
38．方积年等．亮菌多糖的研究I．ATM组分的分离纯化及其性质．生物化学及生物物理学报，1984，16(3)：222～227
39．傅博强等．茶叶多糖的提取纯化、组成及药理作用研究进展．2001，25(4)：358～363
40．蔡鸿恩．中西医结合茶治疗糖尿病初步疗效报告．茶叶通报，1979，11(2)：58～59
41．李布青等．中低档绿茶中茶多糖的提取及降血糖作用．茶叶科学，1996，16(1)：67～72
42．陈海霞等．茶多糖不同提取工艺的比较研究．食品工业科技，2001，22(2)：18～19
43．周集体等．超滤浓缩担子菌发酵液聚合物的研究．大连理工大学学报，1999，39(3)：415～419
44．黄罗生等．不同超滤条件对四逆汤中乌头总碱、甘草酸及固含量的影响．中成药，2002，24(3)：165～167
45．武汉大学化学系高分子物化小组编．高分子物化实验讲义．
46．周杰等．茶多糖分离提取技术研究．食品与发酵工业，2001，28(3)：83～84
47．章银良等．螺旋藻多糖提取新工艺的研究．食品与发酵工业，1998，25(2)：15～18
48．孙玉军．木通多糖的分离纯化及部分理化性质测定．安徽技术师范学院学报，2001，15(4)：60～61
49．汪东风等．茶多糖的组分及理化性质．茶叶科学，1996，16(1)：1～6
50．陈和生等．罗田板栗多糖的分离纯化及成分分析．中国药学杂志，2002，37,(1)：63～64
51．徐桂云等．用毛细管气相色谱法测定多糖中单糖的组成．分析测试学报，2000，19(3)：71～72
52．徐桂云，常理文等．牛颔下腺粘蛋白中糖组成的毛细管气相色谱分析．分析化学，1998，26(8)：922
53．杨坚．正交实验法．西南食品学院食品学院．
54．南京农业大学主编．田间试验和统计方法．农业出版社，1985
55．徐继初主编．生物统计与试验设计．农业出版社，1990
56．日本膜学会．膜分离过程设计法．北京：科学技术文献出版社，1988
57．朱彬华．超滤法浓缩α-淀粉酶的研究．膜科学与技术，1988，3：15～20
58. Staud A M. Methods in Cardohybrate Chemistry. V General Polysaccharides. New York. Academic Press. 1965, 5
59. Yoshida S. Distribution of the molecular weight and chemical form of intrinsic iron compounds on soybeans. Agric Biolchem. 1989,53(4): 1070～1075
60. Tsumura Morin Co. Extraction of hypolycemics from tea. CA, 1991,115:142239
61. Ito En Co., Ltd. Rido Chemical Co., Ltd. Extraction of hypolycemics from tea. CA. 1992,117(8):76468
62．盖钧镒主编．试验统计方法．中国农业出版社，2000
63．王冕主编．Word 2002．人民邮电出版社，2001．
64．洪锦魁，李劲编．Excel 2002．人民邮电出版社，2001
2. Masayuki Suzuki et al. Characteristic distribution of 2-O-(β-L-Arabinopyranosyl)-Myo-Inositol in tea plant (Camellia sinonsis), Proceedings of the International Symposium on Tea science, Japan, 1991. 135～139
3．陈宗道等．微生物与普洱茶发酵．茶叶科技，1985(4)：4-7
4．汪东风等．茶叶多糖及其药理作用进展．天然药物研究与开发，1996(3)：63～67
5. Wang dongfeng et al. Study of pharmaceutical components in coarse tea on curing diabetes. Proceedings of the '95 International Tea-Quality-Human Health Symposium,china, 1995.84～86
6．黄桂宪等．广西绿茶多糖的分离与分析．中国茶叶，1995(5)：18～19
7．汪东风等．粗老茶中的多糖含量及其保健作用．茶叶科学，1994，14(1)：73～74
8．萧伟祥等．茶多糖生物活性与结构的研究进展．中国茶叶，2002，24(1)：14～15
9．张惟杰．糖复合物生化研究技术．浙江大学出版社．1999
10．朱秋军．香菇多糖的分离纯化及理化性质的研究．华中农业大学硕士论文，1998
11．张龙翔等．生化实验方法和技术．人民教育出版社，1981
12．屠幼英．绿茶饮料中茶多糖的构成．茶叶，2001，27(2)：22～24
13．赵国华．四种根茎类食物活性多糖的研究．西南农业大学博士论文，2001
14. Ito En Co, Ltd, Rido Chemical Co. Ltd. (Takeo C, kinugasa H), Oosu H),JP04,124,139, Chemical Abstrats, 1992, 117(8):76468
15．叶盛等．茶叶多糖及其生物活性．茶叶科学技术，2001(1)：8～11
16．安徽农业大学主编．茶叶生物化学(第二版)．北京：农业出版社，1988
17．王淑如等．茶叶多糖的抗凝血及抗血栓作用．中草药，1992，23(5)：254～256
18．汪东风等．粗老茶治疗糖尿病的药理成分分析．中草药，1995，26(5)：255～257
19．王丁刚等．茶叶多糖的降血糖、抗炎及碳廓清作用．茶叶科学，1991，11(2)：173～174
20. Kenichi E, Tokuro T, Tadakazu T. Proceedings of the International Symposium on Tea Science, 1991,8,26～29, Shizuoka Japan/The Organizing Committee of ISTS, 1992,240～242
21. Reed Chemical K K(Mori M, Morita N, Ikeoaya K). JP 63,308,001,Chemical Abstracts, 1989,111:140472
22．王丁刚，王淑如．茶叶多糖的分离、纯化、分析及降血脂作用．中国药科大学学报，
1991，22(4)：225～228
23．楼福庆等．茶叶与动脉粥样硬化．浙江医学，1981，3(4)：5
24．肖慧等．茶多糖的提取与纯化研究．茶业通报，1993，11(4)：5～6
25．涂茂兵．香菇多糖的提取工艺的优化研究．天津轻工学院硕士论文，1995
26．方积年等．香菇多糖的分离纯化方法．专利，1995
27．崔福生等．医学生化检验手册．天津科学技术出版社，1982
28．中国农业科学院茶叶研究所主编．茶树生理及茶叶生化实验手册．农业出版社，1983
29．程启坤主编．茶化浅析．中国农科院茶叶研究所资料研究室，1982
30．张俐娜等．动态膜渗透压法测定生漆多糖水溶液．高分子学报，1989(3)：370～373
31．倪德江等．脱蛋白工艺对茶多糖提取率及蛋白质含量德影响．中国茶叶，2002，24(4)：6～7
32．汪东风等．茶多糖等有效成分综合提取．中草药，1998，29(11)：739～740
33．王玉琦等．分子活化法分析研究多功能铁芒萁叶中稀土结合多糖．中国科学，1997，27(6)：64～68
34．邓俊林等．茶叶多糖的分离，纯化及分析．重庆师范学院学报，1998，15(2)：37～38
35. Treveluan WE and Harrison JS. Studies on yeast metabolism biochem J 1952,50:298
36. Nelly Blumenkrantz and Gustav Asboe-hansen. New method for uronic acids. Anal biochem 1973,54:484
37．魏远安等．高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量．药学学报，1989，24(7)：532～536
38．方积年等．亮菌多糖的研究I．ATM组分的分离纯化及其性质．生物化学及生物物理学报，1984，16(3)：222～227
39．傅博强等．茶叶多糖的提取纯化、组成及药理作用研究进展．2001，25(4)：358～363
40．蔡鸿恩．中西医结合茶治疗糖尿病初步疗效报告．茶叶通报，1979，11(2)：58～59
41．李布青等．中低档绿茶中茶多糖的提取及降血糖作用．茶叶科学，1996，16(1)：67～72
42．陈海霞等．茶多糖不同提取工艺的比较研究．食品工业科技，2001，22(2)：18～19
43．周集体等．超滤浓缩担子菌发酵液聚合物的研究．大连理工大学学报，1999，39(3)：415～419
44．黄罗生等．不同超滤条件对四逆汤中乌头总碱、甘草酸及固含量的影响．中成药，2002，24(3)：165～167
45．武汉大学化学系高分子物化小组编．高分子物化实验讲义．
46．周杰等．茶多糖分离提取技术研究．食品与发酵工业，2001，28(3)：83～84
47．章银良等．螺旋藻多糖提取新工艺的研究．食品与发酵工业，1998，25(2)：15～18
48．孙玉军．木通多糖的分离纯化及部分理化性质测定．安徽技术师范学院学报，2001，15(4)：60～61
49．汪东风等．茶多糖的组分及理化性质．茶叶科学，1996，16(1)：1～6
50．陈和生等．罗田板栗多糖的分离纯化及成分分析．中国药学杂志，2002，37,(1)：63～64
51．徐桂云等．用毛细管气相色谱法测定多糖中单糖的组成．分析测试学报，2000，19(3)：71～72
52．徐桂云，常理文等．牛颔下腺粘蛋白中糖组成的毛细管气相色谱分析．分析化学，1998，26(8)：922
53．杨坚．正交实验法．西南食品学院食品学院．
54．南京农业大学主编．田间试验和统计方法．农业出版社，1985
55．徐继初主编．生物统计与试验设计．农业出版社，1990
56．日本膜学会．膜分离过程设计法．北京：科学技术文献出版社，1988
57．朱彬华．超滤法浓缩α-淀粉酶的研究．膜科学与技术，1988，3：15～20
58. Staud A M. Methods in Cardohybrate Chemistry. V General Polysaccharides. New York. Academic Press. 1965, 5
59. Yoshida S. Distribution of the molecular weight and chemical form of intrinsic iron compounds on soybeans. Agric Biolchem. 1989,53(4): 1070～1075
60. Tsumura Morin Co. Extraction of hypolycemics from tea. CA, 1991,115:142239
61. Ito En Co., Ltd. Rido Chemical Co., Ltd. Extraction of hypolycemics from tea. CA. 1992,117(8):76468
62．盖钧镒主编．试验统计方法．中国农业出版社，2000
63．王冕主编．Word 2002．人民邮电出版社，2001．
64．洪锦魁，李劲编．Excel 2002．人民邮电出版社，2001