光合细菌对水产养殖病害细菌的拮抗功能及机理研究
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摘要
从河水、鱼塘底泥等样品中分离到28株紫色非硫光合细菌，分别对其进行鉴定和生理特性研究。试验结果表明，28株分离菌株均属于红假单胞菌属，其中18株为沼泽红假单胞菌（Rps.palustris）、9株为胶质红假单胞菌（Rps.gelatinosa），1株为球形红假单胞菌（Rps.sphaeroides）。通过对紫色非硫光合细菌不同分离株的碳源利用能力、培养条件、脱氢酶活性以及去除养殖水体NH4+-N、NO2 -N和COD能力的比较，结果显示不同菌株的生理功能存在较大差异。
选用从淡水分离的代表菌株球形红假单胞菌PSB-3、胶质红假单胞菌H1和沼泽红假单胞菌H10与实验室保藏菌种荚膜红假单胞菌PSB-2进行拮抗功能研究，测定其抑菌谱与最低抑菌浓度。结果表明，4株紫色非硫光合细菌的代谢产物对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等29株水产养殖病原菌与人体条件致病菌均有抑制作用，但对病原真菌无抑菌作用。在4株光合细菌中，荚膜红假单胞菌的抑菌活性强于其他菌株，对多数病原菌的最低抑菌浓度为8~16AU/ml，而其他光合细菌为4~16AU/ml。4株光合细菌对部分耐药菌株的抑菌效果优于抗菌素的抑菌作用。光合细菌在细胞生长初期不具有抑菌表征，细胞生长进入对数期后抑菌活性逐渐增强，当细胞生长至稳定期或衰亡期达到最大的抑菌活性；细胞经破碎后，其抑菌活性增强。
研究环境因素对4株紫色非硫光合细菌代谢产物抑菌活性的影响，试验表明pH值、氨氮和亚硝基氮浓度对其抑菌活性影响较大：pH7~9，抑菌活性较强；氨氮和亚硝基氮浓度越低，抑菌效果越好；抑菌活性对温度、养殖水体的溶氧变化不敏感。紫色非硫光合细菌拮抗产物具有很好的热稳定性；对蛋白酶K和α-糜蛋白酶不敏感，对胰蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶较敏感；但其抑菌活性不受紫外照射的影响。
紫色非硫光合细菌的去细胞上清液，进行CM-Sephadex C-50柱层析或CM-650M高效液相色谱分离，分离纯化得到的抑菌蛋白对伤寒沙门氏菌BF1016和嗜水气单胞菌A.h均具有抑菌活性。4株紫色非硫光合细菌的抑菌蛋白经毛细管区带电泳检测，其分离图谱基本为一条谱带，均已达到较高纯度。荚膜红假单胞菌PSB-2和沼泽红假单胞菌H10抑菌蛋白的SDS-PAGE电泳结果也显示出已达到电泳纯。荚膜红假单胞菌PSB-2分泌的抑菌蛋白经MALDI-TOF质谱检测，其准确分子量为9290Da。根据其抑菌蛋白的性质，初步判断紫色非硫光合细菌在对数期产生的拮抗物质为细菌素，可归为小分子热稳定肽类。
本文关于紫色非硫光合细菌分离鉴定、生理功能、拮抗功能、拮抗物质的分离纯化与性质表征的研究成果为建立光合细菌生物防治水产养殖动物病害基础
理论，推广光合细菌在实际生产中的应用具有重要意义。
Twenty-eight strains of purple nonsulfer photosynthetic bacteria (PNB) isolated from river water and fish-pond mud were identified, and their characteristics were studied. The experimental results showed that above twenty-eight strains all belonged to Rhodopseudomonas, eighteen of these strains were identified as Rps.palustris, nine strains were Rps.gelatinosa, and one strain was Rps.sphaeroides. There are many differences among the experimental strains in utilization abilities of different carbon sources, culture conditions, dehydrogenase activity and abilities of removing NH4+-N, NO2 -N and COD of aquaculture water.
The antibiotic abilities of Rps.sphaeroides PSB-3, Rps.gelatinosa H1, and Rps.palustris H10 which were separated from fresh water, and preserved Rps.capsulata PSB-2 were assayed. Inhibition tests on solid medium showed that, four strains of PNB displayed a broad inhibitory spectrum. Twenty-nine strains of pathogens which caused important diseases in aquaculture and human clinical diseases such as Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus and so on were sensitive to the metabolic products of PNB. But fungus pathogens were all resistant to the four strains of PNB. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the metabolic products of PNB was determined by using agar disk dilution method. Rps.capsulata had the strongest antibacterial activity among four strains of PNB, and its MIC against the majority of bacteria pathogens was 8~16AU/ml. MIC of other PNB were only 4~16AU/ml. Compared the antagonism of PNB with antibiotics, the antagonistic products produced by the four strains of PNB had obvious antibacterial effect on some drug-resistant strains. There was no antibacterial effect during the initial stage of cellular growth. The antagonistic activity of PNB began to increase in exponential phase, reached maximum in the stationary and death phases, and increased when the PNB cells were disintegrated with ultrasonication.
Effects of environmental factors on the antibacterial activities of four purple nonsulfer photosynthetic bacterial metabolic products were studied. It showed that their antibacterial activities were affected significantly by pH and the concentration of
NH4+-N and NO2 -N: antimicrobial effects were strong between pH 7 and 9 and under low concentration of NH4+-N and NO2 -N, but antimicrobial activities was not sensitive to the change of temperature and dissolved oxygen in aquaculture water. The antagonistic products produced by PNB were heat-stable; the inhibitory activities of PNB was not lost upon treatment with proteanase K, α-chymotrypsin, and ultraviolet radiation, but sensitive to trypsin, pepsin, and subtilisin.
The antagonistic substances in cell-free supernatant (CFS) of purple nonsulfer photosynthetic bacteria purified by column chromatography on CM-Sephadex C-50 and CM-650M HPLC were determined by SDS-PAGE, capillary zone electrophoresis (CZE) and mass spectrometry. The purified antibacterial proteins had a strong inhibiting activities against the pathogens of Salmonella typhi BF1016 and Aeromonas hydrophila A.h. Only one band was shown when four antibacterial proteins were checked by CZE. The antibacterial proteins of Rps.capsulata PSB-2 and Rps.palustris H10 were confirmed as electrophoresis purity with SDS-PAGE. The molecular weigh of antibacterial protein produced by Rps.capsulata PSB-2 was 9290Da. According to their characteristics, the antagonistic substances produced by PNB in exponential phase were bacteriocin and they had been classified into small heat-stable peptide (SHSP).
The result of this paper including studies on isolation, identification, physiological and antagonistic function of purple nonsulfer photosynthetic bacterium, purification and characterization of antagonistic substances is helpful to establish basic theory on biological control of photosynthetic bacteria over diseases in aquaculture and popularize application of PSB in practical production.
选用从淡水分离的代表菌株球形红假单胞菌PSB-3、胶质红假单胞菌H1和沼泽红假单胞菌H10与实验室保藏菌种荚膜红假单胞菌PSB-2进行拮抗功能研究，测定其抑菌谱与最低抑菌浓度。结果表明，4株紫色非硫光合细菌的代谢产物对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等29株水产养殖病原菌与人体条件致病菌均有抑制作用，但对病原真菌无抑菌作用。在4株光合细菌中，荚膜红假单胞菌的抑菌活性强于其他菌株，对多数病原菌的最低抑菌浓度为8~16AU/ml，而其他光合细菌为4~16AU/ml。4株光合细菌对部分耐药菌株的抑菌效果优于抗菌素的抑菌作用。光合细菌在细胞生长初期不具有抑菌表征，细胞生长进入对数期后抑菌活性逐渐增强，当细胞生长至稳定期或衰亡期达到最大的抑菌活性；细胞经破碎后，其抑菌活性增强。
研究环境因素对4株紫色非硫光合细菌代谢产物抑菌活性的影响，试验表明pH值、氨氮和亚硝基氮浓度对其抑菌活性影响较大：pH7~9，抑菌活性较强；氨氮和亚硝基氮浓度越低，抑菌效果越好；抑菌活性对温度、养殖水体的溶氧变化不敏感。紫色非硫光合细菌拮抗产物具有很好的热稳定性；对蛋白酶K和α-糜蛋白酶不敏感，对胰蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶较敏感；但其抑菌活性不受紫外照射的影响。
紫色非硫光合细菌的去细胞上清液，进行CM-Sephadex C-50柱层析或CM-650M高效液相色谱分离，分离纯化得到的抑菌蛋白对伤寒沙门氏菌BF1016和嗜水气单胞菌A.h均具有抑菌活性。4株紫色非硫光合细菌的抑菌蛋白经毛细管区带电泳检测，其分离图谱基本为一条谱带，均已达到较高纯度。荚膜红假单胞菌PSB-2和沼泽红假单胞菌H10抑菌蛋白的SDS-PAGE电泳结果也显示出已达到电泳纯。荚膜红假单胞菌PSB-2分泌的抑菌蛋白经MALDI-TOF质谱检测，其准确分子量为9290Da。根据其抑菌蛋白的性质，初步判断紫色非硫光合细菌在对数期产生的拮抗物质为细菌素，可归为小分子热稳定肽类。
本文关于紫色非硫光合细菌分离鉴定、生理功能、拮抗功能、拮抗物质的分离纯化与性质表征的研究成果为建立光合细菌生物防治水产养殖动物病害基础
理论，推广光合细菌在实际生产中的应用具有重要意义。
Twenty-eight strains of purple nonsulfer photosynthetic bacteria (PNB) isolated from river water and fish-pond mud were identified, and their characteristics were studied. The experimental results showed that above twenty-eight strains all belonged to Rhodopseudomonas, eighteen of these strains were identified as Rps.palustris, nine strains were Rps.gelatinosa, and one strain was Rps.sphaeroides. There are many differences among the experimental strains in utilization abilities of different carbon sources, culture conditions, dehydrogenase activity and abilities of removing NH4+-N, NO2 -N and COD of aquaculture water.
The antibiotic abilities of Rps.sphaeroides PSB-3, Rps.gelatinosa H1, and Rps.palustris H10 which were separated from fresh water, and preserved Rps.capsulata PSB-2 were assayed. Inhibition tests on solid medium showed that, four strains of PNB displayed a broad inhibitory spectrum. Twenty-nine strains of pathogens which caused important diseases in aquaculture and human clinical diseases such as Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus and so on were sensitive to the metabolic products of PNB. But fungus pathogens were all resistant to the four strains of PNB. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the metabolic products of PNB was determined by using agar disk dilution method. Rps.capsulata had the strongest antibacterial activity among four strains of PNB, and its MIC against the majority of bacteria pathogens was 8~16AU/ml. MIC of other PNB were only 4~16AU/ml. Compared the antagonism of PNB with antibiotics, the antagonistic products produced by the four strains of PNB had obvious antibacterial effect on some drug-resistant strains. There was no antibacterial effect during the initial stage of cellular growth. The antagonistic activity of PNB began to increase in exponential phase, reached maximum in the stationary and death phases, and increased when the PNB cells were disintegrated with ultrasonication.
Effects of environmental factors on the antibacterial activities of four purple nonsulfer photosynthetic bacterial metabolic products were studied. It showed that their antibacterial activities were affected significantly by pH and the concentration of
NH4+-N and NO2 -N: antimicrobial effects were strong between pH 7 and 9 and under low concentration of NH4+-N and NO2 -N, but antimicrobial activities was not sensitive to the change of temperature and dissolved oxygen in aquaculture water. The antagonistic products produced by PNB were heat-stable; the inhibitory activities of PNB was not lost upon treatment with proteanase K, α-chymotrypsin, and ultraviolet radiation, but sensitive to trypsin, pepsin, and subtilisin.
The antagonistic substances in cell-free supernatant (CFS) of purple nonsulfer photosynthetic bacteria purified by column chromatography on CM-Sephadex C-50 and CM-650M HPLC were determined by SDS-PAGE, capillary zone electrophoresis (CZE) and mass spectrometry. The purified antibacterial proteins had a strong inhibiting activities against the pathogens of Salmonella typhi BF1016 and Aeromonas hydrophila A.h. Only one band was shown when four antibacterial proteins were checked by CZE. The antibacterial proteins of Rps.capsulata PSB-2 and Rps.palustris H10 were confirmed as electrophoresis purity with SDS-PAGE. The molecular weigh of antibacterial protein produced by Rps.capsulata PSB-2 was 9290Da. According to their characteristics, the antagonistic substances produced by PNB in exponential phase were bacteriocin and they had been classified into small heat-stable peptide (SHSP).
The result of this paper including studies on isolation, identification, physiological and antagonistic function of purple nonsulfer photosynthetic bacterium, purification and characterization of antagonistic substances is helpful to establish basic theory on biological control of photosynthetic bacteria over diseases in aquaculture and popularize application of PSB in practical production.
引文
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