川贝母多倍体诱导及其过氧化物酶同功酶的分析
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摘要
川贝母为我国传统名贵中草药，在市场上一直供不应求，但由于生长条件要求苛刻，再加上长期以来的滥采滥挖，野生资源已经濒临枯竭。国内外许多研究者都对川贝母的组织培养进行了研究，并且获得了较好的效果。而中药材在多倍化后一般都存在“巨型性”的特点，有效成分和植株的生长量上都有所增加，能够较好的满足中药材生产的需要，结合组织培养和秋水仙碱处理进行多倍体诱导在许多药用植物中都已经获得成功。目前川贝母的组织培养技术已经成熟，而其多倍体研究还是空白。本文就对用组织培养和秋水仙碱处理相结合的方法诱导川贝母多倍体进行了一定的研究，为以后的川贝母优良品种的选育打下了基础。
本文用川贝母无菌鳞茎在MS+6-BA2mg／L+NAA1mg／L+CH500mg／L+蔗糖30g／L的培养基中诱导形成愈伤组织。通过将不同浓度的秋水仙碱加入培养基和不同浓度的秋水仙碱溶液浸泡两种方法处理愈伤组织，从而筛选出最佳的诱导方法和最佳的秋水仙碱浓度和处理时间。经染色体数目鉴定表明，这两种方法都能有效的诱导四倍体细胞(2n=4x=48)的产生，而二倍体染色体数为2n=2x=24，但是加入培养基法无论在诱导率上还是在操作上都优于液体浸泡法。其中以在培养基中加入500～1000mg／L秋水仙碱，处理时间为5～10d，诱导效果较好，1000mg／L的浓度处理5d最为理想，加倍率达70％。将分化出来的植株转入MS+NAA2mg／L的生根培养基中，待根伸长至0.5cm时进行根尖染色体鉴定，筛选出四倍体植株。
对处理过的愈伤组织和分化四倍体植株的过氧化物同功酶分析表明：四倍体与二倍体相比并不是成倍的增加，四倍体过氧化物酶同功酶与二倍体存在一定的差异。与对照相比，秋水仙碱处理后的川贝母愈伤组织的过氧化物酶同功酶的活性和酶带数目都发生了变化，过氧化物酶活性有所提高，并观察到新的
酶带产生，也有一些二倍体有的酶带在处理后的愈伤组织中没有出现;而分化
的四倍体植株的过氧化物酶同功酶只有表达量的提高，未见新的酶带产生。说
明愈伤组织状态下和完整植株的过氧化物酶代谢调节方式可能不同，并且同源
四倍体与原二倍体的生化表现上也有所不同。
通过以上研究，我们得到了川贝母同源四倍体诱导的最佳方法和秋水仙碱
的最佳处理浓度和处理时间，并且分化鉴定出了四倍体植株，并从过氧化物同
功酶变化，辅以形态解剖学观察、染色体鉴定，为川贝母的育种工作做了初步
的研究，也为川贝母的资源保护做了有意义的工作。
Fritillaria cirrhosa D.Don is a famous and precious traditional Chinese medicinal plant belonging to the Liliaceae family. In Chinese herbal practices, in which the bulb is generally eaten, it is highly effective for the treatment of relieving cough, removing phlegm, reducing fever and moistening lungs. It is especially effective in the treatment of the elderly and children, particularly in cases of difficult recovery after a lengthy treatment. As a result, the demand of supply in the Chinese drug market is always high. But because of restricted growth requirements and unlimited digging, its nature resources are close to drying up. Considerable efforts in the tissue culture of Fritillaria cirrhosa have been successful. Herbs have character of huge shape after being polyploided, medicinal composition and growing mass are increasing and satisfy the produce of medicinal materials preferably. Combining tissue culture with colchicines treatment induce autopolyploid success in many medicinal plants. Now the tissue culture technique of Fritillaria cirrhosa is perfect, but its polyploid research is vacant. We induce the polyploid of Fritillaria cirrhosa combining tissue culture with colchicines treatment primarily in the article.
Calli were induced by culturing germfree bulb in the MS medium supplemented with 2.0mg/L 6-BA and 1 .Omg/L NAA. The diploid wound callus was treated by adding colchicines into the medium and by immersing into colchicines solution for different concentrations and periods. Colchicines concentrations were four levels of 100,500,1000 and 2000 mg/L, and treatment periods were of 1, 5 and
10 days for the former and 24,48 and 72h for the latter. The results showed that both the two methods can induce polyploid cells, but the former was better than the latter in the induction rate and operating. The induced effects on Fritillaria cirrhosa callus treated by colchicines with different concentrations and different time were varying, and were better in 500-1000 mg/L with 5-10 days. 1000 mg/L with 5 days was the best and its doubling efficiency was up to 70%. The callus treated was culturing in the MS medium supplemented with 2mg/L NAA to get the root. Microscopic examination of callus and shoot tips showed that the chromosome number of tetraploid was 2n=4x=48, while that of diploid was 2n=2x=24.
In this paper, we also study the change of peroxidase isozymes of the callus treated by adding colchicines into the medium and the regenerated tetraploid plants. The results showed that callus and the plants had different regulated modes on peroxidase. Compared with the control, the band number and activity of peroxidase isozymes of callus treated with colchicines were changed obviously, and two new enzyme bands appeared, and some bands disappeared, while the regenerated tetraploid plants only showed the activity raising. So the regenerated tetraploid plant and its diploid were different in inheritance.
By the upper research, the best induction method of Fritillaria cirrhosa's polyploid and appropriate concentration and periods of colchicines were obtained, the tetraploid plants were got and identified. The acquaintance of polyploid was deeper via the morphological and cytological examination and peroxidase isozymes.
本文用川贝母无菌鳞茎在MS+6-BA2mg／L+NAA1mg／L+CH500mg／L+蔗糖30g／L的培养基中诱导形成愈伤组织。通过将不同浓度的秋水仙碱加入培养基和不同浓度的秋水仙碱溶液浸泡两种方法处理愈伤组织，从而筛选出最佳的诱导方法和最佳的秋水仙碱浓度和处理时间。经染色体数目鉴定表明，这两种方法都能有效的诱导四倍体细胞(2n=4x=48)的产生，而二倍体染色体数为2n=2x=24，但是加入培养基法无论在诱导率上还是在操作上都优于液体浸泡法。其中以在培养基中加入500～1000mg／L秋水仙碱，处理时间为5～10d，诱导效果较好，1000mg／L的浓度处理5d最为理想，加倍率达70％。将分化出来的植株转入MS+NAA2mg／L的生根培养基中，待根伸长至0.5cm时进行根尖染色体鉴定，筛选出四倍体植株。
对处理过的愈伤组织和分化四倍体植株的过氧化物同功酶分析表明：四倍体与二倍体相比并不是成倍的增加，四倍体过氧化物酶同功酶与二倍体存在一定的差异。与对照相比，秋水仙碱处理后的川贝母愈伤组织的过氧化物酶同功酶的活性和酶带数目都发生了变化，过氧化物酶活性有所提高，并观察到新的
酶带产生，也有一些二倍体有的酶带在处理后的愈伤组织中没有出现;而分化
的四倍体植株的过氧化物酶同功酶只有表达量的提高，未见新的酶带产生。说
明愈伤组织状态下和完整植株的过氧化物酶代谢调节方式可能不同，并且同源
四倍体与原二倍体的生化表现上也有所不同。
通过以上研究，我们得到了川贝母同源四倍体诱导的最佳方法和秋水仙碱
的最佳处理浓度和处理时间，并且分化鉴定出了四倍体植株，并从过氧化物同
功酶变化，辅以形态解剖学观察、染色体鉴定，为川贝母的育种工作做了初步
的研究，也为川贝母的资源保护做了有意义的工作。
Fritillaria cirrhosa D.Don is a famous and precious traditional Chinese medicinal plant belonging to the Liliaceae family. In Chinese herbal practices, in which the bulb is generally eaten, it is highly effective for the treatment of relieving cough, removing phlegm, reducing fever and moistening lungs. It is especially effective in the treatment of the elderly and children, particularly in cases of difficult recovery after a lengthy treatment. As a result, the demand of supply in the Chinese drug market is always high. But because of restricted growth requirements and unlimited digging, its nature resources are close to drying up. Considerable efforts in the tissue culture of Fritillaria cirrhosa have been successful. Herbs have character of huge shape after being polyploided, medicinal composition and growing mass are increasing and satisfy the produce of medicinal materials preferably. Combining tissue culture with colchicines treatment induce autopolyploid success in many medicinal plants. Now the tissue culture technique of Fritillaria cirrhosa is perfect, but its polyploid research is vacant. We induce the polyploid of Fritillaria cirrhosa combining tissue culture with colchicines treatment primarily in the article.
Calli were induced by culturing germfree bulb in the MS medium supplemented with 2.0mg/L 6-BA and 1 .Omg/L NAA. The diploid wound callus was treated by adding colchicines into the medium and by immersing into colchicines solution for different concentrations and periods. Colchicines concentrations were four levels of 100,500,1000 and 2000 mg/L, and treatment periods were of 1, 5 and
10 days for the former and 24,48 and 72h for the latter. The results showed that both the two methods can induce polyploid cells, but the former was better than the latter in the induction rate and operating. The induced effects on Fritillaria cirrhosa callus treated by colchicines with different concentrations and different time were varying, and were better in 500-1000 mg/L with 5-10 days. 1000 mg/L with 5 days was the best and its doubling efficiency was up to 70%. The callus treated was culturing in the MS medium supplemented with 2mg/L NAA to get the root. Microscopic examination of callus and shoot tips showed that the chromosome number of tetraploid was 2n=4x=48, while that of diploid was 2n=2x=24.
In this paper, we also study the change of peroxidase isozymes of the callus treated by adding colchicines into the medium and the regenerated tetraploid plants. The results showed that callus and the plants had different regulated modes on peroxidase. Compared with the control, the band number and activity of peroxidase isozymes of callus treated with colchicines were changed obviously, and two new enzyme bands appeared, and some bands disappeared, while the regenerated tetraploid plants only showed the activity raising. So the regenerated tetraploid plant and its diploid were different in inheritance.
By the upper research, the best induction method of Fritillaria cirrhosa's polyploid and appropriate concentration and periods of colchicines were obtained, the tetraploid plants were got and identified. The acquaintance of polyploid was deeper via the morphological and cytological examination and peroxidase isozymes.
引文
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