信息获取与评价用于六味地黄丸有效成分群的辨识研究
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摘要
针对中药复方物质基础研究的现状，选择了谱效学研究的思路和方法，选择中药复方六味地黄丸作为研究对象，在中医理论的指导下，进行中药化学成分指纹谱和生物效应谱相关性分析。建立以现代中医理论为指导、中药指纹图谱为核心、多指标成分定量分析为手段的中药的复方质量控制模式与评价方法，为中药复杂体系的分析提供方法学的集成创新。
本课题采用HPLC-DAD-TOF/MS色谱联用技术，对六味地黄丸各种剂型进行了定性定量研究。首先通过建立六味地黄丸化学成分数据库，结合对照品比对和HPLC-IT/MS结构解析，对六味地黄丸的指纹图谱成分进行了鉴别，得到了明晰化的六味地黄丸指纹图谱，能够代表六味地黄丸中的多数色谱信息，为进一步谱效相关性的研究建立了基础。同时对六味地黄丸中6个指标性成分-没食子酸、5-羟甲基糠醛、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷和丹皮酚进行了含量测定，对不同剂型和不同厂家中主要成分的差异进行研究，结果表明不同剂型和不同厂家之间存在含量差异，而同一厂家的含量具有一致性。
近红外光谱技术是最适于实现在线分析和实时控制的成熟技术之一，已经得到广泛应用。可避免测量过程可能带来的污染，是一种“绿色分析技术”。以近红外光谱技术为核心的中药生产过程智能化控制技术，是通过将近红外在线检测集成到中药自动化生产线的多个环节中，形成中药生产质量控制新模式。结合建立的六味地黄丸色谱分析方法，采用近红外光谱技术，将近红外在线检测集成到中药自动化生产线的多个环节中，建立根据中药内在质量进行自动控制的中药生产质量控制新模式，研究建立了六味地黄丸提取过程的近红外光谱在线分析方法，建立了六味地黄丸提取过程的4个指标成分丹皮酚、芍药苷、马钱苷和没食子酸的光谱校正模型。用此模型分析六味地黄丸提取过程，得到了比较满意的结果。研究表明，近红外光谱技术可用于六味地黄丸提取过程的在线分析及预测。
六味地黄丸在临床的应用中，用于治疗的多种疾病和下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴平衡失调有关。HPG轴是神经内分泌免疫调节(NIM)网络的重要组成部分，HPG轴平衡失调是NIM网络平衡失调的重要原因之一。本研究通过建立经典的中医模型-肾阴虚模型，主要研究六味地黄丸对小鼠肾阴虚的免疫作用，六味地黄丸治疗的许多疾病和下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴平衡失调有关。研究摘除双侧卵巢后，雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴各环节激素水平的变化，研究六味地黄丸不同剂型对动物内分泌的作用，结果表明不同剂型的六味地黄丸具有明显的免疫作用，但不同剂型之间不存在显著差异。
化学计量学是一门应用数学、统计学和计算机技术的原理和方法来处理化学数据的学问，可以从化学量测数据中最大限度地提取有用的化学信息，其中模式识别在中药研究中被用作中药质量研究的一种重要数据分析方法。建立了多个厂家不同剂型的六味地黄丸的指纹图谱，结合主成分分析（PCA）、聚类分析（HCA）等无监督的模式识别方法对六味地黄丸进行分类研究，通过应用偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）进行不同剂型和厂家的质量评价，通过PLS-DA建立合理的模型后，发现5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、没食子酸等成分对蜜丸和浓缩丸的分类具有关键作用，故可用作六味地黄丸制剂的化学标记物，可作为质量控制的指标性成分和进一步研究的方向。
综合色谱数据信息和药效评价信息，采用LARS（Least Angle RegressionAlgorithm）回归算法进行了谱效学的初步相关研究，对11个批次六味地黄丸指纹图谱和相关免疫药效数据进行分析评价，采用该算法在指纹谱中寻找与药效相关的成分，发现了多个具有一定价值的化学成分，本研究可为建立中药指纹图谱与药效学相关的复方中药质量控制模式提供一种方法学的研究创新。
Chromatography hyphenated technology like HPLC-DAD-TOF/MS was employed toanalyze the components in the wide-used Chinese patantdrug-liuweidihuangwan(LWDHW). The databases of chemical components in the herbwere established firstly. The peaks in the chromatographic fingerprint of LWDHW wereidentified by comparing the characters and structural elucidation with HPLC-IT/MS andthe better distinct fingerprint was obtained. The HPLC method was established todeterminate the contents of5-HMF, gallic acid, loganin, sweroside, paeoniflorin andpaeonol in LWDHW.
Kidney-yin-vacuity was modling to study the effect of LWDHW on the immunity forKidney-yin-vacuity rat. The diseases treated by LWDHW ralate to the dysfunction ofhypothalamus-pituitary-gonad. The changes of hormonal readiness in each units ofHypothalamus-pituitary-ovarian Axis in ovariectomized female rats are abserved toresearch the effect of LWDHW in internal secretion of animals.
Near infrared spectroscopy combined the established chromatographic method wasemployed to determinate the several active components in the sections of automatic line toproduce LWDHW. The new quality control model ofChinese Materia Medica production was constructed according to the interal quality ofTCM.
The chromatographic fingerprints of LWDHW with different manufactures anddifferent preparations were established. Several multivariable data analysis methods suchas PCA, HCA and PLS-DA were employed to evaluate the quality of LWDHW withdifferent manufactures and different preparations and the chemical marks was obtained tobe as the indicial compounds.
Least Angle Regression Algorithm was applied to evaluate the relationship ofchromatographic fingerprints and pharmacological action of LWDHW. Combinedinformation of fingerprints and pharmacology of11batchs LWDHW were used to get theative ingridents. The established method layed the foundation of TCM quality controlrelated to pharmacology.
本课题采用HPLC-DAD-TOF/MS色谱联用技术，对六味地黄丸各种剂型进行了定性定量研究。首先通过建立六味地黄丸化学成分数据库，结合对照品比对和HPLC-IT/MS结构解析，对六味地黄丸的指纹图谱成分进行了鉴别，得到了明晰化的六味地黄丸指纹图谱，能够代表六味地黄丸中的多数色谱信息，为进一步谱效相关性的研究建立了基础。同时对六味地黄丸中6个指标性成分-没食子酸、5-羟甲基糠醛、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷和丹皮酚进行了含量测定，对不同剂型和不同厂家中主要成分的差异进行研究，结果表明不同剂型和不同厂家之间存在含量差异，而同一厂家的含量具有一致性。
近红外光谱技术是最适于实现在线分析和实时控制的成熟技术之一，已经得到广泛应用。可避免测量过程可能带来的污染，是一种“绿色分析技术”。以近红外光谱技术为核心的中药生产过程智能化控制技术，是通过将近红外在线检测集成到中药自动化生产线的多个环节中，形成中药生产质量控制新模式。结合建立的六味地黄丸色谱分析方法，采用近红外光谱技术，将近红外在线检测集成到中药自动化生产线的多个环节中，建立根据中药内在质量进行自动控制的中药生产质量控制新模式，研究建立了六味地黄丸提取过程的近红外光谱在线分析方法，建立了六味地黄丸提取过程的4个指标成分丹皮酚、芍药苷、马钱苷和没食子酸的光谱校正模型。用此模型分析六味地黄丸提取过程，得到了比较满意的结果。研究表明，近红外光谱技术可用于六味地黄丸提取过程的在线分析及预测。
六味地黄丸在临床的应用中，用于治疗的多种疾病和下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴平衡失调有关。HPG轴是神经内分泌免疫调节(NIM)网络的重要组成部分，HPG轴平衡失调是NIM网络平衡失调的重要原因之一。本研究通过建立经典的中医模型-肾阴虚模型，主要研究六味地黄丸对小鼠肾阴虚的免疫作用，六味地黄丸治疗的许多疾病和下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴平衡失调有关。研究摘除双侧卵巢后，雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴各环节激素水平的变化，研究六味地黄丸不同剂型对动物内分泌的作用，结果表明不同剂型的六味地黄丸具有明显的免疫作用，但不同剂型之间不存在显著差异。
化学计量学是一门应用数学、统计学和计算机技术的原理和方法来处理化学数据的学问，可以从化学量测数据中最大限度地提取有用的化学信息，其中模式识别在中药研究中被用作中药质量研究的一种重要数据分析方法。建立了多个厂家不同剂型的六味地黄丸的指纹图谱，结合主成分分析（PCA）、聚类分析（HCA）等无监督的模式识别方法对六味地黄丸进行分类研究，通过应用偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）进行不同剂型和厂家的质量评价，通过PLS-DA建立合理的模型后，发现5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、没食子酸等成分对蜜丸和浓缩丸的分类具有关键作用，故可用作六味地黄丸制剂的化学标记物，可作为质量控制的指标性成分和进一步研究的方向。
综合色谱数据信息和药效评价信息，采用LARS（Least Angle RegressionAlgorithm）回归算法进行了谱效学的初步相关研究，对11个批次六味地黄丸指纹图谱和相关免疫药效数据进行分析评价，采用该算法在指纹谱中寻找与药效相关的成分，发现了多个具有一定价值的化学成分，本研究可为建立中药指纹图谱与药效学相关的复方中药质量控制模式提供一种方法学的研究创新。
Chromatography hyphenated technology like HPLC-DAD-TOF/MS was employed toanalyze the components in the wide-used Chinese patantdrug-liuweidihuangwan(LWDHW). The databases of chemical components in the herbwere established firstly. The peaks in the chromatographic fingerprint of LWDHW wereidentified by comparing the characters and structural elucidation with HPLC-IT/MS andthe better distinct fingerprint was obtained. The HPLC method was established todeterminate the contents of5-HMF, gallic acid, loganin, sweroside, paeoniflorin andpaeonol in LWDHW.
Kidney-yin-vacuity was modling to study the effect of LWDHW on the immunity forKidney-yin-vacuity rat. The diseases treated by LWDHW ralate to the dysfunction ofhypothalamus-pituitary-gonad. The changes of hormonal readiness in each units ofHypothalamus-pituitary-ovarian Axis in ovariectomized female rats are abserved toresearch the effect of LWDHW in internal secretion of animals.
Near infrared spectroscopy combined the established chromatographic method wasemployed to determinate the several active components in the sections of automatic line toproduce LWDHW. The new quality control model ofChinese Materia Medica production was constructed according to the interal quality ofTCM.
The chromatographic fingerprints of LWDHW with different manufactures anddifferent preparations were established. Several multivariable data analysis methods suchas PCA, HCA and PLS-DA were employed to evaluate the quality of LWDHW withdifferent manufactures and different preparations and the chemical marks was obtained tobe as the indicial compounds.
Least Angle Regression Algorithm was applied to evaluate the relationship ofchromatographic fingerprints and pharmacological action of LWDHW. Combinedinformation of fingerprints and pharmacology of11batchs LWDHW were used to get theative ingridents. The established method layed the foundation of TCM quality controlrelated to pharmacology.
引文
[1]罗国安,王义明,中药指纹图谱的分类与发展,中国新药杂志,2002,11(1):46-51
[2]罗国安,王义明,曹进,多维多息特征谱及其应用,中成药,2000,22(6):395-397
[3]秦浩，林志娟，陈景武,偏最小二乘法回归原理、分析步骤及程序,数理医药学杂志,2007,20(4):450-1
[4]孟阳，彭柏源,毕志明等,生地黄化学成分研究,中药材，2005,28(4):293-4
[5]曾艳,贾正平,张汝学,地黄化学成分及药理研究进展,中成药,2006,28(4):609-11
[6]王太霞,李景原,胡正海,地黄的形态结构与化学成分研究进展,中草药,2004,35(5):585-587
[7]徐晓杰,宋丽丽,朱新科等,近红外光谱法用于六味地黄丸粉末混合过程中的质量控制研究,中国现代应用药学杂志,2006,23(7):644-46
[8]于承浩,吕清涛,王晶,聚类判别分析方法评价六味地黄丸质量的研究,山东中医药大学学报,2002,26(5):375-8
[9]张健萍,李连珍,赵红红等,牡丹皮的化学成分、药理作用及临床应用研究概况.中华中医药杂志2006,21（5）:295-7
[10]王祝举,唐立英,赫炎.牡丹皮的化学成分和药理作用,国外医药-植物分册,2006,21(4):155-9
[11]国家药典委员会，中华人民共和国药典(一部)[S]，北京：化学工业出版社，2000：248．
[12]杨剑芳,路福平,高文远等,山茱萸的化学、药理及开发应用研究.现代生物医学进展,2006,6(12):127-33
[13]王喜军,张宁,孙辉等,六味地黄丸的血清药物化学研究,中国天然药物,2004,2(4):219-12
[14]肖飞艳,冯育林,杨世林等,泽泻化学成分的研究进展,中药新药与临床药理.2009(5)
[15]胡雪艳,陈海霞,高文远等,泽泻化学成分的研究,中草药.2008(12)
[16]丁霞,吴水生泽泻的研究进展,中医药信息.2008(5)
[17]胡斌.茯苓化学成分的研究[D].中国科学院上海药物研究所,2004.
[18]胡斌,杨益平,叶阳等.茯苓化学成分研究[J].中草药,2006,37(5):655-658.
[19]王帅,姜艳艳,朱乃亮等.茯苓化学成分分离与结构鉴定[J].北京中医药大学学报,2010,33(12):841-844.
[20]白冰,李明静,王勇等.怀山药化学成分研究[J].中国中药杂志,2008,33(11):1272-1274.
[21]宋君柳.山药品种资源及化学成分研究进展[J].长江蔬菜,2009,(6):1-5.DOI:10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.001.
[22] Chen, JH,Zhao, HQ,Shi, Q et al.Rapid screening and identification of the antioxidants inHippocampus japonicus Kaup by HPLC-ESI-TOF/MS and on-line ABTS free radical scavengingassay[J].Journal of separation science,2010,33(4/5):672-677.
[23] Max Bylesjo,Mattias Rantalainen,Olivier Cloarec et al.OPLS discriminant analysis:combining thestrengths of PLS-DA and SIMCA classification[J].Journal of Chemometrics,2006,20(8/10):341-351.
[24] Ulf G.Indahl,Harald Martens,Tormod Naes et al.From dummy regression to prior probabilities inPLS-DA[J].Journal of Chemometrics,2007,21(12):529-536.
[25]丁晴,徐德然,王峥涛等.HPLC法测定六味地黄丸及六味地黄胶囊中齐墩果酸、熊果酸的含量[J].中国中药杂志,2002,27(8):587-589.
[26]张燕敏,赵仪学,景连叶等.HPLC法测定六味地黄胶囊中丹皮酚的含量[J].河南中医学院学报,2009,24(1):52-53.
[27]申安,闫昌.薄层色谱扫描法测定六味地黄浓缩丸中熊果酸含量的不确定度评定[J].河南中医学院学报,2009,24(3):36-38.
[28]徐飞,尹蓉莉,赖庆宽等.不同提取工艺的六味地黄复方提取物对肾阴虚模型小鼠的药理作用比较[J].中国药房,2007,18(6):418-420.
[29]傅万山,杨解人,丁伯平等.六味地黄丸对肾上腺皮质激素型肾阴虚小鼠的药效学研究[J].皖南医学院学报,2002,21(1):11-12,15.
[30]邹玲玲.六味地黄丸指纹图谱与药效相关性研究[D].上海中医药大学,2009.
[31]王德秀,胡旭光,臧建伟等.六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠HPA轴的调节作用研究[J].陕西中医,2008,29(3):374-375.
[32]胡旭光,臧建伟,唐春萍等.六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响[J].时珍国医国药,2008,19(5):1033-1034.
[33]徐勤,杜标炎,罗惠等.六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用(Ⅱ)[J].广州中医药大学学报,2000,17(3):207-208.
[34]李振坤,陈建新,杨洪军等.基于LARS算法的川芎成分组合与血管活性关系分析[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(3):24-27.
[35]唐思文,徐登峰,王玲玲等.芪苈强心胶囊多目标优化组合物对实验性心衰大鼠心功能的保护作用[J].中药新药与临床药理,2011,(5):532-535.
[36]王伟,赵慧辉,陈建新等.基于Lars算法的冠心病血瘀证的特征模式研究[C].//第十一届中国科协年会论文集.2009:300-303.
[37]张志祥,刘鹏,康华靖等.基于主成分分析和聚类分析的FTIR不同地理居群香果树多样性分化研究[J].光谱学与光谱分析,2008,28(9):2081-2086.
[38]杨在君,张利,杨瑞武等.中药丹参及其近缘种中微量元素的主成分和聚类分析[J].光谱学与光谱分析,2008,28(10):2441-2445..
[39]钱国华,荀鹏程,陈峰等.偏最小二乘法降维在微阵列数据判别分析中的应用[J].中国卫生统计,2007,24(2):120-123.
[40] Lee K S;Lim B V;Chang H K.Liuweidihuang-tang improves spatial memory function and increasesneurogenesis in the dentate gyrus in rats[J].Fitoterapia,2005,76:514-519.
[41] Yan Ding,Enqi Wu,Jianbo Chen et al.Quality Evaluation of Moutan Cortex Radicis Using MultipleComponent Analysis by High Performance Liquid Chromatography[J].Bulletin of the Korean ChemicalSociety,2009,30(10):2240-2244.
[42] He, Q,Ge, ZW,Song, Y et al.Quality evaluation of cortex moutan by high performance liquidchromatography coupled with diode array detector and electrospary ionization tandem massspectrometry[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2006,54(9):1271-1275.
[43] Masayuki Yoshikawa,Toshio Ohta,Atsuhiro Kawaguchi et al.Bioactive Constituents of ChineseNatural Medicines. V. Radical Scavenging Effect of Moutan Cortex.(1): Absolute Stereostructures ofTwo Monoterpenes, Paeonisuffrone and Paeonisuffral[J].Chemical and PharmaceuticalBulletin,2000,48(9):1327-1331.
[44] Ha do T,Tuan DT,Thu NB et al.Palbinone and triterpenes from Moutan Cortex (Paeoniasuffruticosa, Paeoniaceae) stimulate glucose uptake and glycogen synthesis via activation of AMPK ininsulin-resistant human HepG2Cells.[J].Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters,2009,19(19):5556-5559.
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[46] Lin HC,Ding HY,Wu TS et al.MONOTERPENE GLYCOSIDES FROM PAEONIASUFFRUTICOSA[J].Phytochemistry,1996,41(1):237-242
[47]顾海,姜泽群,姜海英等.5-羟甲基糠醛对过氧化氢致大鼠海马神经细胞损伤的保护作用研究[J].南京中医药大学学报,2011,27(5):437-440
[48]顾海,江亚兵,姜海英等.5-羟甲基糠醛对过氧化氢诱导的凋亡海马神经细胞BCL-2、NF-B表达的影响[J].2011,34(11):1753-1756
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[2]罗国安,王义明,曹进,多维多息特征谱及其应用,中成药,2000,22(6):395-397
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[6]王太霞,李景原,胡正海,地黄的形态结构与化学成分研究进展,中草药,2004,35(5):585-587
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[8]于承浩,吕清涛,王晶,聚类判别分析方法评价六味地黄丸质量的研究,山东中医药大学学报,2002,26(5):375-8
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[10]王祝举,唐立英,赫炎.牡丹皮的化学成分和药理作用,国外医药-植物分册,2006,21(4):155-9
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[12]杨剑芳,路福平,高文远等,山茱萸的化学、药理及开发应用研究.现代生物医学进展,2006,6(12):127-33
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[33]徐勤,杜标炎,罗惠等.六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用(Ⅱ)[J].广州中医药大学学报,2000,17(3):207-208.
[34]李振坤,陈建新,杨洪军等.基于LARS算法的川芎成分组合与血管活性关系分析[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(3):24-27.
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