从HPA轴水平初步探讨缺血性中风急性期补肾护脑法的生物学基础
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摘要
中风病急性期的治疗一直是医学界关注的重点,它直接关系到中风病的预后转归和功能恢复。“扶正”与“祛邪”在中风病的治疗中相辅相成,贯穿始终,急性期治疗多采用偏重祛邪的方法,但在临床实践中我们发现,早期应用“扶正”的方法对促进功能恢复、改善预后转归具有重要的意义。本研究在病证结合模式指导下,从理论、实验、临床多方面入手,从脑肾相关的角度探讨了缺血性中风急性期应用补肾法对促进功能恢复、改善预后转归的积极作用,以期完善中医脑病理论,并为中风病疗效评价体系提供生物学的效应指标。
理论研究部分：利用脑病文献库对650余本古代医籍的电子图书进行整理,将其中与脑肾理论相关的论述内容梳理分类,从组织结构络属、生理功能联系、病因病机影响、理法方药应用多层次论述了脑肾关系。肾藏精,精生髓,髓通于脑,脑为髓会聚之处,二者密切相关,组织结构、生理功能等方面的内在联系,构成了它们在病因病机上相互影响的重要基础,也是临床中运用补肾法治疗中风病的理论依据。
动物实验部分：
目的：通过观察MCAO模型大鼠缺血后不同时点ACTH、CRH和COR的动态变化,地黄饮子加减方对ACTH、CRH和COR表达的干预作用及其对神经细胞凋亡、HSP70表达水平的影响,探讨其在脑缺血后纠正HPA轴功能紊乱、促进神经保护的作用效应,以揭示缺血性中风病早期应用补肾中药对脑组织的保护机制,也为临床应用补肾护脑法减轻神经功能缺损和神经元损伤、改善预后转归提供了理论依据。
方法：健康雄性SD大鼠,体重280g±10g。第一部分实验中随机分为正常组、假手术组、模型组,每组分为两个时点,每个时点8只,手术组采用改良的线栓法建立MCAO模型,分别于造模后6h、48h取材,检测血ACTH、CRH、COR含量,以多聚甲醛灌注固定取脑,于视交叉处将大脑前后分开,将脑组织石蜡包埋切片,切片厚度约为4μm,做HE染色观察神经细胞形态的变化,用免疫组织化学染色方法观察不同时间点脑组织细胞凋亡的表达。第二部分实验中随机分为模型组、中药组、假手术组,每组10只,造模后第2天开始灌胃,地黄饮子组每日灌胃中药1ml·kg-1,模型组和假手术组灌胃等体积的蒸馏水,连续7天,于最后一次灌胃结束后1h取材,检测血ACTH、CRH、COR含量,以多聚甲醛灌注固定取脑,将脑组织石蜡切片做HE染色观察神经细胞形态的变化,并用免疫组织化学染色方法观察细胞凋亡和HSP70的表达。
结果：
1.血浆ACTH、CRH、COR含量的测定结果
在脑缺血发生后6h,模型组和假手术组的CRH、ACTH、COR含量明显均低于正常组,统计学结果有显著差异；在48h时模型组ACTH、COR的含量明显高于正常组和6h模型组,统计学结果有显著差异；CRH的含量较6h时进一步降低,明显低于正常组,统计学结果有显著差异。
2.MCAO大鼠不同缺血时点脑组织细胞凋亡表达
模型组大鼠造模后6h即可见TUNEL染色阳性细胞,48h仍可见,与正常组和假手术组比较,有极显著差异(P<0.01),但6h与48h组之间统计学无明显差异。
3.地黄饮子加减方对MCAO大鼠血浆HPA轴的干预作用
脑缺血发生后7天,模型组的ACTH、CRH含量均明显低于正常组,COR含量明显高于正常组,统计学有显著差异；地黄饮子组的COR明显低于正常组、模型组,统计学有显著差异；地黄饮子组ACTH、CRH含量均明显高于模型组,统计学有显著差异；ACTH、CRH含量略低于正常组,统计学无差异。COR与ACTH和CRH呈反向性变化。
4.地黄饮子对MCAO大鼠缺血后脑组织细胞凋亡表达的干预效应
灌胃7天后的MCAO大鼠,模型组、中药组均可见脑组织有细胞凋亡表达,二者与正常组相比,统计学结果有显著差异(P<0.01)；模型组脑组织细胞凋亡表达较中药组明显,模型组与中药组相比,统计学结果有显著差异(P<0.01)。
5.MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织细胞凋亡表达的相关性分析
模型组ACTH含量与脑组织细胞凋亡表达的TUNEL染色结果存在显著负相关关系,但CRH、COR则与凋亡表达无明显相关性。中药组ACTH、CRH、COR三者与脑组织细胞凋亡表达无明显相关性。
6.地黄饮子对MCAO模型大鼠脑组织HSP70表达的干预效应
同正常组比较,模型组和中药组脑组织均有HSP70表达,且统计学有显著差异；同模型组相比,中药组脑组织的HSP70表达更为明显,统计学有显著差异。
7.MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织HSP70表达的相关性分析
模型组COR含量与脑组织HSP70表达存在显著正相关关系,但CRH、ACTH则与HSP70表达无明显相关性。中药组HPA轴各指标与脑组织HSP70表达无明显相关性。
结论：
1.脑缺血后6h,HPA轴呈抑制状态；脑缺血后48h,HPA轴明显紊乱,可能是该时点症状加重、死亡率增高的一个原因。
2.地黄饮子加减方可以改善MCAO模型大鼠术后的整体状态,减轻动物体重下降率。
3.地黄饮子加减方可以通过提高CRH的含量来抑制大鼠体内COR的释放,从而改善HPA轴的紊乱状态。
4.地黄饮子加减方可以明显抑制脑组织细胞凋亡的表达,这种作用可能与其改善HPA轴的紊乱状态有关。
5.地黄饮子加减方可以通过促进缺血区脑组织HSP70的表达发挥神经保护作用。
临床研究部分：以病证结合模式为指导,探讨缺血性中风急性期证候与生物学指标的相关性,本研究病例的数据来源于国家重点基础研究发展计划(973计划)课题-缺血性中风病证结合的诊断标准与疗效评价体系研究(课题编号：2003CB517102)。使用《缺血性中风证候要素诊断量表》,纳入211例急性期缺血性中风病患者,动态采集四诊信息以判断证候要素,采集血清标本进行生物学指标ACTH、COR、HSP70的检测,初步探讨了它与中医证候、病机在生物学基础层面的关系,从一定程度上完善了缺血性中风病证结合的诊断标准,为建立早期运用补肾中药对缺血性中风患者预后影响的临床疗效评价体系提供了生物学指标依据,同时也为构建完整的中医脑病理论体系奠定了基础。
In recent, there has been growing concerning about treatment of acute stroke which has implications for prognosis and rehabil itat ion. In Tranditional Chinese medicine (TCM), "reinforcing the healthy qi" and "eliminating the pathogenic factors" are the main methods of treatment throughout the pathological process of stroke. Current trends in treatment of acute stroke was with an emphasis on "eliminating the pathogenic factors", whereas through summarizing the clinical experience, "reinforcing the healthy qi" were found exerting significant effect to improve prognosis and rehabilitation. With the integrating disease and syndrome pattern, this study is to explore positive function of "reinforcing the healthy qi " treatment in acute phase on improving prognosis and rehabilitation from the perspective of "combination with kindey and brain" in order to provide the biomark of evaluting the effecacy of acute stroke. Theory research:
The theory about "combination with kindey and brain" was screened and catagoried with respects to organizational structure, Physiological function, Pathogenesis and application of herbs from 650 ancient medical books involved in an e-book archive. The kidney stores the essence, essence produces marrow, marrow connects to brain, and brain is the convergence of marrow, the brain and kidney have close relationship. Organizational structure and physiological function not only composes an important basis of interaction on the pathogenesis, but also provides the theoretical basis of clinical treatment for acute stroke. Animal experiment:
Objective:To investigate dynamic level changes of ACTH, CRH and COR of MCAO rats at different time point, expression levels of ACTH, CRH, COR were detected by ELISA at 6h and 48h after cerebral ischemia. To determine if Dihuangyinzi decoction interferes with the HPA axis, apoptosis process and the expression of HSP70 in MCAO rats and to explore the role of Dihuangyinzi decoction in neuroprotection effect and improving the disturbed condition of HPA axis, the morphological changes of neural cell and apoptosis in cerebral histiocyte were detected by staining brains slices with hematoxylin-eosin(HE) and imunohistochemical (IHC) method. In summary, this study was with the aim of revealing neuroprotection mechanism and basis theory with application of reinforcing kidney herbs in acute phase of stroke.
Method:Male Sprague-Dawley (SD) rats of body weight 280±10g were used for this test.
Part one:48 SD rats were randomly divided into 3 groups:normal group, sham operatedgroup and MCAO model group, each group was 16. MCAO was induced by inserting a nylon monofilament through the external carotid artery into theintracranial circulation to occlude the middle cerebral artery at its origin. SD rats were killed 6 or 48h after cerebral ischemia. The expression levels of ACTH, CRH, COR were detected by ELISA at 6h and 48h after cerebral ischemia.Furthemore, the brain specimens were fixed in paraformaldehyde, embedded in paraffin, and then cut into Sagittal slices of 4μm thickness.
To detect the morphological changes of neural cell and apoptosis in cerebr al histiocytes, brain slices were staind with hematoxylin-eosin (HE) and Ini-munohistochemical(IHC) method, respectively.
Part two:30 SD rats were randomly divided into 3 groups:MCAO model group, herb formula group,and sham operated group,each group was 10. For drug tre atment, herb formula group were given Dihuangyinzi decoction from 2days to 8days after ischemia (1ml/kg body mass) by intragastric administration met hod, whereas the MCAO model group and sham operated group received equivale nt volumes of distilled water. SD rats were killed 1h after the last intrag astric administration. The expression levels of ACTH, CRH, COR were detecte d by ELISA. Furthemore, the brain specimens were fixed in paraformaldehyde, embedded in paraffin, and then cut into Sagittal slices of 4μm thickness. To detect the morphological changes of neural cell, apoptosis in cerebral histiocytes and the expression of HSP70, brain slices were staind with hema toxylin-eosin(HE) and imunohistochemical (IHC) method, respectively.
Result:
1. Expression levels of ACTH, CRH and COR in serum
The levels of ACTH, CRH and COR at 6h after ischemia were significantly lower in MCAO model group and sham operated group than in normal group(P<0.05); the levels of ACTH, COR were significantly greater in MCAO model group at 48h after ischemia than that in normal group and MCAO model group at 6h after ischemia(P<0.05); the level of CRH at 48h after ischemia in MCAO model group was significantly lower in MCAO model group at 6h after ischemia and in normal group (P<0.05).
2. Apoptosis in cerebral histiocytes of MCAO rats at different time point.
TUNEL-positive cerebral histiocytes were found by light microscope in MCAO model group at 6h and 48h after ischemia specimens (vs normal group and sham operated group, P<0.01), however, there was no significant difference between MCAO model group at 6h after ischemia and MCAO model group at 48h after ischemia. 3 Dihuangyinzi decoction interferes with the HPA axis serum reaction of MCAO
At 8days after ischemia, the levels of ACTH, CRH were significantly lower in MCAO model group than in normal group (P<0.05), the level of COR in MCAO model group were significantly higher than that in normal group; The level of COR was significantly lower in herb formula group than in normal and MCAO model group; The levels of ACTH, CRH were significantly higher in herb formula group than in MCAO model group, the levels of ACTH, CRH were lower in herb formula group than in normal group withou significant difference.
A reverse change was observed between the level of ACTH, CRH and the level of COR.
4. Dihuangyinzi decoction interferes with apoptosis in cerebral histiocytes of MCAO rats.
At 7days after intragastric administration, TUNEL-positive cerebral histiocytes were found in MCAO model group and herb formula group (vs normal group, P<0.01); The level of apoptosis in cerebral histiocytes was significantly greater in MCAO model group than in herb formula group (P<0.01).
5. Correlation analysis between apoptosis in cerebral histiocytes and HPA axis serum reaction of MCAO rats.
In MCAO model group, there was significantly negative correlation between the level of ACTH and apoptosis in cerebral histiocytes by TUNEL staining, while there were no correlations between the levels of CRH, COR and the apoptosis in cerebral histiocytes. In herb formula group, there were no correlations between the levels of ACTH,CRH, COR and the apoptosis in cerebral histiocytes.
6. Dihuangyinzi decoction interferes with the expression of HSP70 in cerebral tissu of MCAO rats.
The expression of HSP70 were found in MCAO model group and herb formula group (vs normal group, P<0.05); The expression of HSP70 was significantly greater in herb formula group than in MCAO model group (P<0.05).
7. Correlation analysis between the expression of HSP70 in cerebral tissu and HPA axis serum reaction of MCAO rats.
In MCAO model group, there was significantly positive correlation between the level of COR and the expression of HSP70, while there were no correlations between the levels of CRH, ACTH and the expression of HSP70. In herb formula group, there were no correlations between the levels of ACTH,CRH, COR and the expression of HSP70 in cerebral tissue.
Conclusion:
1. At 6h after ischemia, HPA axis serum reaction was in an inhibited state. At 48h after ischemia, HPA axis serum reaction was in an obviously disturbed condition which might lead to more complicated syptoms and higher mortality.
2. Dihuangyinzi decoction can improve the holistic state of MCAO rats and prevent from weight loss.
3. Dihuangyinzi decoction can inhibit the release of COR by increasing the level of CRH, which can improve the disturbed condition of HPA axis serum reaction.
4. Dihuangyinzi decoction can obviously inhibit apoptosis in cerebral histiocytes, which may have implication for improving the disturbed condition of HPA axis serum reaction
5. Dihuangyinzi decoction can exert neuroprotection effect by enhancing the expression of HSP70 in the ischemia cerebral tissue.
Clinical reseach:
Under the guidance of "integrating disease and syndrome" research model, this study revealed the correlations between TCM syndrome and biomarker in acute phase of ischemic stroke. All the cases of this study have been chosen from National Point Foundation Research Development Plan (973 plan)---Ischemic Stroke Diagnosis Combining Symptoms and Signs of Disease and Effect Evaluation System Research. (No.2003CB517102). In this study, to explore the relationship between biomarker and TCM syndrome and to develop the diagnosic standards for ischemic stroke under the "integrating disease and syndrome" pattern, " Ischemic Stroke TCM Syndrome Factor Diagnostic Scale" (ISTSFDS) was collected for Syndrome diagnosis and serum samples were collected for detecting the levels of ACTH, COR and HSP70. In summary, this study may provide the theoretical basis of TCM neurology.
理论研究部分：利用脑病文献库对650余本古代医籍的电子图书进行整理,将其中与脑肾理论相关的论述内容梳理分类,从组织结构络属、生理功能联系、病因病机影响、理法方药应用多层次论述了脑肾关系。肾藏精,精生髓,髓通于脑,脑为髓会聚之处,二者密切相关,组织结构、生理功能等方面的内在联系,构成了它们在病因病机上相互影响的重要基础,也是临床中运用补肾法治疗中风病的理论依据。
动物实验部分：
目的：通过观察MCAO模型大鼠缺血后不同时点ACTH、CRH和COR的动态变化,地黄饮子加减方对ACTH、CRH和COR表达的干预作用及其对神经细胞凋亡、HSP70表达水平的影响,探讨其在脑缺血后纠正HPA轴功能紊乱、促进神经保护的作用效应,以揭示缺血性中风病早期应用补肾中药对脑组织的保护机制,也为临床应用补肾护脑法减轻神经功能缺损和神经元损伤、改善预后转归提供了理论依据。
方法：健康雄性SD大鼠,体重280g±10g。第一部分实验中随机分为正常组、假手术组、模型组,每组分为两个时点,每个时点8只,手术组采用改良的线栓法建立MCAO模型,分别于造模后6h、48h取材,检测血ACTH、CRH、COR含量,以多聚甲醛灌注固定取脑,于视交叉处将大脑前后分开,将脑组织石蜡包埋切片,切片厚度约为4μm,做HE染色观察神经细胞形态的变化,用免疫组织化学染色方法观察不同时间点脑组织细胞凋亡的表达。第二部分实验中随机分为模型组、中药组、假手术组,每组10只,造模后第2天开始灌胃,地黄饮子组每日灌胃中药1ml·kg-1,模型组和假手术组灌胃等体积的蒸馏水,连续7天,于最后一次灌胃结束后1h取材,检测血ACTH、CRH、COR含量,以多聚甲醛灌注固定取脑,将脑组织石蜡切片做HE染色观察神经细胞形态的变化,并用免疫组织化学染色方法观察细胞凋亡和HSP70的表达。
结果：
1.血浆ACTH、CRH、COR含量的测定结果
在脑缺血发生后6h,模型组和假手术组的CRH、ACTH、COR含量明显均低于正常组,统计学结果有显著差异；在48h时模型组ACTH、COR的含量明显高于正常组和6h模型组,统计学结果有显著差异；CRH的含量较6h时进一步降低,明显低于正常组,统计学结果有显著差异。
2.MCAO大鼠不同缺血时点脑组织细胞凋亡表达
模型组大鼠造模后6h即可见TUNEL染色阳性细胞,48h仍可见,与正常组和假手术组比较,有极显著差异(P<0.01),但6h与48h组之间统计学无明显差异。
3.地黄饮子加减方对MCAO大鼠血浆HPA轴的干预作用
脑缺血发生后7天,模型组的ACTH、CRH含量均明显低于正常组,COR含量明显高于正常组,统计学有显著差异；地黄饮子组的COR明显低于正常组、模型组,统计学有显著差异；地黄饮子组ACTH、CRH含量均明显高于模型组,统计学有显著差异；ACTH、CRH含量略低于正常组,统计学无差异。COR与ACTH和CRH呈反向性变化。
4.地黄饮子对MCAO大鼠缺血后脑组织细胞凋亡表达的干预效应
灌胃7天后的MCAO大鼠,模型组、中药组均可见脑组织有细胞凋亡表达,二者与正常组相比,统计学结果有显著差异(P<0.01)；模型组脑组织细胞凋亡表达较中药组明显,模型组与中药组相比,统计学结果有显著差异(P<0.01)。
5.MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织细胞凋亡表达的相关性分析
模型组ACTH含量与脑组织细胞凋亡表达的TUNEL染色结果存在显著负相关关系,但CRH、COR则与凋亡表达无明显相关性。中药组ACTH、CRH、COR三者与脑组织细胞凋亡表达无明显相关性。
6.地黄饮子对MCAO模型大鼠脑组织HSP70表达的干预效应
同正常组比较,模型组和中药组脑组织均有HSP70表达,且统计学有显著差异；同模型组相比,中药组脑组织的HSP70表达更为明显,统计学有显著差异。
7.MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织HSP70表达的相关性分析
模型组COR含量与脑组织HSP70表达存在显著正相关关系,但CRH、ACTH则与HSP70表达无明显相关性。中药组HPA轴各指标与脑组织HSP70表达无明显相关性。
结论：
1.脑缺血后6h,HPA轴呈抑制状态；脑缺血后48h,HPA轴明显紊乱,可能是该时点症状加重、死亡率增高的一个原因。
2.地黄饮子加减方可以改善MCAO模型大鼠术后的整体状态,减轻动物体重下降率。
3.地黄饮子加减方可以通过提高CRH的含量来抑制大鼠体内COR的释放,从而改善HPA轴的紊乱状态。
4.地黄饮子加减方可以明显抑制脑组织细胞凋亡的表达,这种作用可能与其改善HPA轴的紊乱状态有关。
5.地黄饮子加减方可以通过促进缺血区脑组织HSP70的表达发挥神经保护作用。
临床研究部分：以病证结合模式为指导,探讨缺血性中风急性期证候与生物学指标的相关性,本研究病例的数据来源于国家重点基础研究发展计划(973计划)课题-缺血性中风病证结合的诊断标准与疗效评价体系研究(课题编号：2003CB517102)。使用《缺血性中风证候要素诊断量表》,纳入211例急性期缺血性中风病患者,动态采集四诊信息以判断证候要素,采集血清标本进行生物学指标ACTH、COR、HSP70的检测,初步探讨了它与中医证候、病机在生物学基础层面的关系,从一定程度上完善了缺血性中风病证结合的诊断标准,为建立早期运用补肾中药对缺血性中风患者预后影响的临床疗效评价体系提供了生物学指标依据,同时也为构建完整的中医脑病理论体系奠定了基础。
In recent, there has been growing concerning about treatment of acute stroke which has implications for prognosis and rehabil itat ion. In Tranditional Chinese medicine (TCM), "reinforcing the healthy qi" and "eliminating the pathogenic factors" are the main methods of treatment throughout the pathological process of stroke. Current trends in treatment of acute stroke was with an emphasis on "eliminating the pathogenic factors", whereas through summarizing the clinical experience, "reinforcing the healthy qi" were found exerting significant effect to improve prognosis and rehabilitation. With the integrating disease and syndrome pattern, this study is to explore positive function of "reinforcing the healthy qi " treatment in acute phase on improving prognosis and rehabilitation from the perspective of "combination with kindey and brain" in order to provide the biomark of evaluting the effecacy of acute stroke. Theory research:
The theory about "combination with kindey and brain" was screened and catagoried with respects to organizational structure, Physiological function, Pathogenesis and application of herbs from 650 ancient medical books involved in an e-book archive. The kidney stores the essence, essence produces marrow, marrow connects to brain, and brain is the convergence of marrow, the brain and kidney have close relationship. Organizational structure and physiological function not only composes an important basis of interaction on the pathogenesis, but also provides the theoretical basis of clinical treatment for acute stroke. Animal experiment:
Objective:To investigate dynamic level changes of ACTH, CRH and COR of MCAO rats at different time point, expression levels of ACTH, CRH, COR were detected by ELISA at 6h and 48h after cerebral ischemia. To determine if Dihuangyinzi decoction interferes with the HPA axis, apoptosis process and the expression of HSP70 in MCAO rats and to explore the role of Dihuangyinzi decoction in neuroprotection effect and improving the disturbed condition of HPA axis, the morphological changes of neural cell and apoptosis in cerebral histiocyte were detected by staining brains slices with hematoxylin-eosin(HE) and imunohistochemical (IHC) method. In summary, this study was with the aim of revealing neuroprotection mechanism and basis theory with application of reinforcing kidney herbs in acute phase of stroke.
Method:Male Sprague-Dawley (SD) rats of body weight 280±10g were used for this test.
Part one:48 SD rats were randomly divided into 3 groups:normal group, sham operatedgroup and MCAO model group, each group was 16. MCAO was induced by inserting a nylon monofilament through the external carotid artery into theintracranial circulation to occlude the middle cerebral artery at its origin. SD rats were killed 6 or 48h after cerebral ischemia. The expression levels of ACTH, CRH, COR were detected by ELISA at 6h and 48h after cerebral ischemia.Furthemore, the brain specimens were fixed in paraformaldehyde, embedded in paraffin, and then cut into Sagittal slices of 4μm thickness.
To detect the morphological changes of neural cell and apoptosis in cerebr al histiocytes, brain slices were staind with hematoxylin-eosin (HE) and Ini-munohistochemical(IHC) method, respectively.
Part two:30 SD rats were randomly divided into 3 groups:MCAO model group, herb formula group,and sham operated group,each group was 10. For drug tre atment, herb formula group were given Dihuangyinzi decoction from 2days to 8days after ischemia (1ml/kg body mass) by intragastric administration met hod, whereas the MCAO model group and sham operated group received equivale nt volumes of distilled water. SD rats were killed 1h after the last intrag astric administration. The expression levels of ACTH, CRH, COR were detecte d by ELISA. Furthemore, the brain specimens were fixed in paraformaldehyde, embedded in paraffin, and then cut into Sagittal slices of 4μm thickness. To detect the morphological changes of neural cell, apoptosis in cerebral histiocytes and the expression of HSP70, brain slices were staind with hema toxylin-eosin(HE) and imunohistochemical (IHC) method, respectively.
Result:
1. Expression levels of ACTH, CRH and COR in serum
The levels of ACTH, CRH and COR at 6h after ischemia were significantly lower in MCAO model group and sham operated group than in normal group(P<0.05); the levels of ACTH, COR were significantly greater in MCAO model group at 48h after ischemia than that in normal group and MCAO model group at 6h after ischemia(P<0.05); the level of CRH at 48h after ischemia in MCAO model group was significantly lower in MCAO model group at 6h after ischemia and in normal group (P<0.05).
2. Apoptosis in cerebral histiocytes of MCAO rats at different time point.
TUNEL-positive cerebral histiocytes were found by light microscope in MCAO model group at 6h and 48h after ischemia specimens (vs normal group and sham operated group, P<0.01), however, there was no significant difference between MCAO model group at 6h after ischemia and MCAO model group at 48h after ischemia. 3 Dihuangyinzi decoction interferes with the HPA axis serum reaction of MCAO
At 8days after ischemia, the levels of ACTH, CRH were significantly lower in MCAO model group than in normal group (P<0.05), the level of COR in MCAO model group were significantly higher than that in normal group; The level of COR was significantly lower in herb formula group than in normal and MCAO model group; The levels of ACTH, CRH were significantly higher in herb formula group than in MCAO model group, the levels of ACTH, CRH were lower in herb formula group than in normal group withou significant difference.
A reverse change was observed between the level of ACTH, CRH and the level of COR.
4. Dihuangyinzi decoction interferes with apoptosis in cerebral histiocytes of MCAO rats.
At 7days after intragastric administration, TUNEL-positive cerebral histiocytes were found in MCAO model group and herb formula group (vs normal group, P<0.01); The level of apoptosis in cerebral histiocytes was significantly greater in MCAO model group than in herb formula group (P<0.01).
5. Correlation analysis between apoptosis in cerebral histiocytes and HPA axis serum reaction of MCAO rats.
In MCAO model group, there was significantly negative correlation between the level of ACTH and apoptosis in cerebral histiocytes by TUNEL staining, while there were no correlations between the levels of CRH, COR and the apoptosis in cerebral histiocytes. In herb formula group, there were no correlations between the levels of ACTH,CRH, COR and the apoptosis in cerebral histiocytes.
6. Dihuangyinzi decoction interferes with the expression of HSP70 in cerebral tissu of MCAO rats.
The expression of HSP70 were found in MCAO model group and herb formula group (vs normal group, P<0.05); The expression of HSP70 was significantly greater in herb formula group than in MCAO model group (P<0.05).
7. Correlation analysis between the expression of HSP70 in cerebral tissu and HPA axis serum reaction of MCAO rats.
In MCAO model group, there was significantly positive correlation between the level of COR and the expression of HSP70, while there were no correlations between the levels of CRH, ACTH and the expression of HSP70. In herb formula group, there were no correlations between the levels of ACTH,CRH, COR and the expression of HSP70 in cerebral tissue.
Conclusion:
1. At 6h after ischemia, HPA axis serum reaction was in an inhibited state. At 48h after ischemia, HPA axis serum reaction was in an obviously disturbed condition which might lead to more complicated syptoms and higher mortality.
2. Dihuangyinzi decoction can improve the holistic state of MCAO rats and prevent from weight loss.
3. Dihuangyinzi decoction can inhibit the release of COR by increasing the level of CRH, which can improve the disturbed condition of HPA axis serum reaction.
4. Dihuangyinzi decoction can obviously inhibit apoptosis in cerebral histiocytes, which may have implication for improving the disturbed condition of HPA axis serum reaction
5. Dihuangyinzi decoction can exert neuroprotection effect by enhancing the expression of HSP70 in the ischemia cerebral tissue.
Clinical reseach:
Under the guidance of "integrating disease and syndrome" research model, this study revealed the correlations between TCM syndrome and biomarker in acute phase of ischemic stroke. All the cases of this study have been chosen from National Point Foundation Research Development Plan (973 plan)---Ischemic Stroke Diagnosis Combining Symptoms and Signs of Disease and Effect Evaluation System Research. (No.2003CB517102). In this study, to explore the relationship between biomarker and TCM syndrome and to develop the diagnosic standards for ischemic stroke under the "integrating disease and syndrome" pattern, " Ischemic Stroke TCM Syndrome Factor Diagnostic Scale" (ISTSFDS) was collected for Syndrome diagnosis and serum samples were collected for detecting the levels of ACTH, COR and HSP70. In summary, this study may provide the theoretical basis of TCM neurology.
引文
制其受体活性,对脑缺血损伤具有防治作用。高维娟等观察益肾降浊汤对脑缺血再灌注大鼠海马组织EAA含量的影响,发现益肾降浊汤可提高缺血再灌注后脑组织细胞内的EAA含量,调节突出间隙EAA浓度,对缺血神经元有保护作用。王华等观察滋肾通络方对大脑中动脉闭塞MCAO大鼠脑组织氨基酸递质含量的影响,发现模型组Asp、G1u、GIy的含量均升高,用药组的Asp、Glu、G1y的含量均降低,且中药组的下降趋势优于西药组,证实滋肾通络方可降低兴奋性氨基酸的含量,从而对脑缺血损伤具有保护作用。张新春等证实,芎芪合剂能够抑制大鼠缺血-再灌注后脑组织中兴奋性氨基酸Glu、Asp含量的增高,并使之趋向于正常,同时还能协同增高大鼠缺血-再灌注后脑组织中抑制性氨基酸G1n、GABA的含量,结果提示芎芪合剂能够通过调整兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的含量,达到减轻大鼠脑缺血-再灌注后脑组织损伤的作用。3.6 抗炎症反应的作用
缺血损伤后产生组织炎性反应,表现在炎性因子上调,促黏附分子和黏附分子的表达增加。已知的致炎因子包括IL-1、IL-6、TNF-α、C5a、PAF等；黏附分子包括ICAM-1、E-选择素、VCAM-1等。中药脑脉通具有解毒降浊、益气活血作用,可以降低TNF、IL-21、IL-28水平以减轻缺血病理过程中由TNF、IL-21、IL-28介导的脑组织损伤。已有实验结果表明,脑脉通能改善脑水肿,并对老龄大鼠脑缺血再灌注脑组织神经细胞病理损伤具有明显保护作用。任国华等研究发现,补肾活血复方能纠正亚急性衰老大鼠慢性脑缺血后各种细胞因子及抗凝因子的失衡,其治疗机制可能是通过扩张脑血管,清除氧自由基,抗炎、抗凝等作用而多途径、多环节来实现的。
中风病之病位在脑,与肾密切相关,肾虚是中风病的基本病机。在生理功能方面,脑为髓之海,真气之所聚,肾为髓之源,脑髓在头,所聚之真气必须下降,以激发肾气,推动脏腑功能活动,肾气通于脑,肾精必须上奉于脑,化生脑髓,使髓海充盈而保证脑的正常功能。《石室秘录》曰“肾气上通于脑,而脑气下达于肾。上下相殊,气实相通”,“补肾则上荫于脑,……肾一足则气即奔腾而不可止”,即是补肾法治疗中风病的理论依据。在临床治疗中,以补肾培元为基本大法,佐以活血、化痰、通络、泄毒等辨证施治,对急性期尤其是起病即有虚证表现的患者可以促进神经功能恢复、改善预后,具有重要的意义；在实验研究中也证实了早期使用补肾方药能够从多方面发挥脑细胞保护的积极作用,为进一步指导临床治疗用药提供了依据。
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通过对古代文献中脑肾关系的梳理,从生理功能、经脉络属、病因病机、临床相关病症、常用补肾代表方剂等多个方面进行了初步的整理。脑肾相关理论中,最核心的内容是“肾通于脑”或者说“肾充于脑”,是指肾的精微物质充养于脑,是脑的形成、发育及功能发挥的物质基础。《灵枢·海论》曰,“髓海有余,则轻劲多力,自过其度；髓海不足,则脑转耳鸣,胫酸眩冒,目无所见,懈怠安卧。”脑髓充足则身强体健,能胜任繁重的工作,髓海不足则会发生晕眩耳鸣,胫酸无力,两目昏花,视力障碍,全身怠废,运动失灵,甚至昏冒不知人事的病理变化。脑为十二官之主,是人体生命活动的主宰。脑与五脏六腑在生理上相互联系,病理上互为影响。脑的功能正常,则五脏六腑各司其职,维持人体生理活动有条不紊；脑病则“五脏六腑皆摇”,百病乃生。反之,脏腑功能活动的正常发挥,是脑神髓海充足,脑主元神正常的前提。若脏腑失常,可因髓、血、真气不足而致脑髓不足,元神虚疲,亦可因脏腑之气上郁于脑,而扰动神明。脑肾相关理论是脑与五脏关系中的重要组成部分,也是指导临床治疗各类脑病的重要理论基础,溯本归源对这部分内容进行系统整理,有助于提高临床的辨证论治水平。
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通过上述关键点的改进,本实验全部动物造模的成功率保证在85%以上,且由于手术步骤的简化,将造模的平均时间控制在30min左右。有利于模型稳定性的提高。2缺血后不同时点的HPA轴变化特点
脑缺血发生6h时,模型组ACTH、CRH、COR的含量均低于正常组,该时点HPA轴的功能呈抑制状态,而假手术组也呈现一致性的变化,提示手术损伤的应激刺激也会使大鼠出现中枢神经系统对HPA轴的调控紊乱。
在脑缺血发生48h时,模型组ACTH、COR的含量较正常组明显升高,二者变化存在一致性。肾上腺皮质的COR受腺垂体内促肾上腺皮质细胞分泌的ACTH刺激而产生,ACTH与COR本身也存在着生理性生物节律性释放和手术、低血糖等应激性释放,此结果支持了张茂林等提出的ACTH、COR含量水平增高程度与脑组织损害成正相关的观点。48h模型组CRH含量则进一步降低,明显低于正常组和6h模型组,因为CRH受下丘脑室旁核小细胞神经元合成和分泌、通过下丘脑-垂体门脉循环转运,以COR为中心的糖皮质激素又分别负反馈作用于垂体和下丘脑(长反馈)、促进海马对下丘脑的抑制,ACTH也反馈抑制下丘脑(短反馈),故而含量降低。在本实验中发现,缺血后48h是模型组大鼠症状加重、趋向死亡的一个高峰时点,可能与HPA轴功能紊乱导致代谢紊乱,抑制免疫和炎症反应,使应激性反应增强,导致机体多器官功能受损或衰竭有关。
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在本实验中,6h与48h各组动物的HPA轴三个值变化与TUNEL染色法的细胞凋亡表达无明显相关性。6h手术组动物的TUNEL染色结果与HPA轴的CRH、ACTH、COR三个值呈负相关趋势。根据实验一的结果,MCAO模型大鼠缺血后6h的HPA轴功能呈抑制状态,该时点二者呈负相关趋势可能与此有关。48h手术组动物的TUNEL染色结果与CRH呈负相关趋势,与ACTH、COR二者呈正相关趋势。在实验一中发现,48h模型组ACTH、COR的含量较正常组明显升高,二者含量变化存在一致性,但CRH的含量则较6h组进一步降低。此结果符合这一相关性趋势的表现。无明显相关性的原因可能与样本量较少及时间点的选择有关。关于HPA轴激素水平与脑组织细胞凋亡表达的研究,多集中在脑缺血后COR释放增加促进血浆糖皮质激素(glucocorticoids,GCS)含量增高,造成神经细胞损伤加重这一机制上。有学者认为,脑缺血后引发的血浆高GCS水平可加重脑缺血再灌注后的神经细胞死亡,高GCS诱导神经细胞死亡的主要形式是细胞凋亡。若早期给予能够降低或抑制GCS含量的药物,可能比单纯拮抗GCS生物学作用的药物有更大的应用价值。关于缺血后HPA轴水平与细胞凋亡表达的相关性,值得进一步探索和挖掘。
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在本实验中观察到,模型组大鼠CRH、ACTH含量均低于正常组,COR明显高于正常组,经地黄饮子灌胃后,可提高大鼠血浆CRH、ACTH含量,使其高于模型组,而COR则明显低于模型组,且差异有显著统计学意义。提示地黄饮子能够改善脑缺血大鼠HPA轴功能的紊乱状态,通过提高CRH含量抑制了大鼠体内COR的释放。这一结果支持了钟历勇、沈自尹等提出的补肾药可通过上调下丘脑CRFmRNA表达来保护HPA轴免受外源性皮质醇的抑制,补肾药对肾阳虚证的主要调节点定位于下丘脑的观点。现代医学研究认为,肾阳虚证与神经内分泌免疫系统(NEIS)有关,肾阳虚证在下丘脑-垂体-靶腺(肾上腺皮质、甲状腺、性腺和胸腺)轴不同环节、不同程度的功能紊乱,且主要发病环节在下丘脑(或更高级)的调节功能紊乱。中风病的病位在脑,脑与肾密切相关。肾虚既是其发病基础,又是病情发展过程中影响预后和病情轻重的关键因素。鉴于肾与脑的密切关系及肾虚在中风病因病机中的重要作用,在临床治疗时对急性期患者尽早采用补肾治疗以扶助正气,对帮助患者脑功能的恢复,减轻脑功能的损害具有重要的意义。
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实验三结果显示,模型组大鼠CRH、ACTH含量均低于正常组,COR明显高于正常组,经地黄饮子灌胃后,可提高大鼠血浆CRH、ACTH含量,使其高于模型组,而COR则明显低于模型组,差异有显著统计学意义。在本实验中,模型组ACTH含量与脑组织细胞凋亡表达的TUNEL染色结果存在显著负相关关系,但CRH、COR则与凋亡表达无明显相关性。说明模型组血浆ACTH含量低于中药组,则细胞凋亡表达较之更为明显。其余指标之间无明显相关性的原因可能与样本量偏少有一定的关系。HPA轴的紊乱程度与肾功能受损程度具有一致性,说明地黄饮子加减方能够通过改善HPA轴的紊乱状态发挥抑制细胞凋亡,发挥脑保护作用的目的。
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4 急性期内HSP70变化水平与预后的相关性
既往研究认为HSP70在脑缺血后的表达高峰期大约出现在第2-5天,约第7天之后开始下降,是细胞内重要的信号转导分子,并在免疫应答中发挥抗原呈递作用,HSP70的抗体参与了脑梗死的发病过程,并通过细胞免疫反应达到保护脑细胞的作用。本研究结果显示,发病60天、90天时的BI指数与急性期内HSP70变化水平并无明显相关性,说明在神经功能缺损程度较轻的这组患者当中,急性期内HSP70的变化水平不是能用于判断预后状态的特异性指标。患者的预后状态受到多种因素的影响,只用一种生物学指标来判断的话确实缺乏客观性和准确性。
5 总结与展望
本研究从脑肾相关理论出发,旨在探讨缺血性中风急性期补肾护脑法的生物学基础。中医理论之肾,是一个包括生殖、遗传、排泄、应激、免疫调节、内外腺体激素分泌、能量代谢等多种功能在内的综合系统。宏观脏器的“肾”实体与多种微观的“功能”系统构筑成一个网络功能态,这个网络与现代医学研究的以HPA轴为核心的NEI网络在功能调控方面有一定的类似之处及重合区。因此本研究在病证结合研究模式的指导思想下,以神经内分泌激素为切入点,初步探讨了它与中医证候、病机在生物学基础层面的关系,从一定程度上完善了缺血性中风病证结合的诊断标准,为建立早期运用补肾中药对缺血性中风患者预后影响的临床疗效评价体系提供了生物学指标依据,同时也为构建完整的中医脑病理论体系奠定了基础。
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中风病之病位在脑,与肾密切相关,肾虚是中风病的基本病机。在生理功能方面,脑为髓之海,真气之所聚,肾为髓之源,脑髓在头,所聚之真气必须下降,以激发肾气,推动脏腑功能活动,肾气通于脑,肾精必须上奉于脑,化生脑髓,使髓海充盈而保证脑的正常功能。《石室秘录》曰“肾气上通于脑,而脑气下达于肾。上下相殊,气实相通”,“补肾则上荫于脑,……肾一足则气即奔腾而不可止”,即是补肾法治疗中风病的理论依据。在临床治疗中,以补肾培元为基本大法,佐以活血、化痰、通络、泄毒等辨证施治,对急性期尤其是起病即有虚证表现的患者可以促进神经功能恢复、改善预后,具有重要的意义；在实验研究中也证实了早期使用补肾方药能够从多方面发挥脑细胞保护的积极作用,为进一步指导临床治疗用药提供了依据。
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通过对古代文献中脑肾关系的梳理,从生理功能、经脉络属、病因病机、临床相关病症、常用补肾代表方剂等多个方面进行了初步的整理。脑肾相关理论中,最核心的内容是“肾通于脑”或者说“肾充于脑”,是指肾的精微物质充养于脑,是脑的形成、发育及功能发挥的物质基础。《灵枢·海论》曰,“髓海有余,则轻劲多力,自过其度；髓海不足,则脑转耳鸣,胫酸眩冒,目无所见,懈怠安卧。”脑髓充足则身强体健,能胜任繁重的工作,髓海不足则会发生晕眩耳鸣,胫酸无力,两目昏花,视力障碍,全身怠废,运动失灵,甚至昏冒不知人事的病理变化。脑为十二官之主,是人体生命活动的主宰。脑与五脏六腑在生理上相互联系,病理上互为影响。脑的功能正常,则五脏六腑各司其职,维持人体生理活动有条不紊；脑病则“五脏六腑皆摇”,百病乃生。反之,脏腑功能活动的正常发挥,是脑神髓海充足,脑主元神正常的前提。若脏腑失常,可因髓、血、真气不足而致脑髓不足,元神虚疲,亦可因脏腑之气上郁于脑,而扰动神明。脑肾相关理论是脑与五脏关系中的重要组成部分,也是指导临床治疗各类脑病的重要理论基础,溯本归源对这部分内容进行系统整理,有助于提高临床的辨证论治水平。
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通过上述关键点的改进,本实验全部动物造模的成功率保证在85%以上,且由于手术步骤的简化,将造模的平均时间控制在30min左右。有利于模型稳定性的提高。2缺血后不同时点的HPA轴变化特点
脑缺血发生6h时,模型组ACTH、CRH、COR的含量均低于正常组,该时点HPA轴的功能呈抑制状态,而假手术组也呈现一致性的变化,提示手术损伤的应激刺激也会使大鼠出现中枢神经系统对HPA轴的调控紊乱。
在脑缺血发生48h时,模型组ACTH、COR的含量较正常组明显升高,二者变化存在一致性。肾上腺皮质的COR受腺垂体内促肾上腺皮质细胞分泌的ACTH刺激而产生,ACTH与COR本身也存在着生理性生物节律性释放和手术、低血糖等应激性释放,此结果支持了张茂林等提出的ACTH、COR含量水平增高程度与脑组织损害成正相关的观点。48h模型组CRH含量则进一步降低,明显低于正常组和6h模型组,因为CRH受下丘脑室旁核小细胞神经元合成和分泌、通过下丘脑-垂体门脉循环转运,以COR为中心的糖皮质激素又分别负反馈作用于垂体和下丘脑(长反馈)、促进海马对下丘脑的抑制,ACTH也反馈抑制下丘脑(短反馈),故而含量降低。在本实验中发现,缺血后48h是模型组大鼠症状加重、趋向死亡的一个高峰时点,可能与HPA轴功能紊乱导致代谢紊乱,抑制免疫和炎症反应,使应激性反应增强,导致机体多器官功能受损或衰竭有关。
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在本实验中,6h与48h各组动物的HPA轴三个值变化与TUNEL染色法的细胞凋亡表达无明显相关性。6h手术组动物的TUNEL染色结果与HPA轴的CRH、ACTH、COR三个值呈负相关趋势。根据实验一的结果,MCAO模型大鼠缺血后6h的HPA轴功能呈抑制状态,该时点二者呈负相关趋势可能与此有关。48h手术组动物的TUNEL染色结果与CRH呈负相关趋势,与ACTH、COR二者呈正相关趋势。在实验一中发现,48h模型组ACTH、COR的含量较正常组明显升高,二者含量变化存在一致性,但CRH的含量则较6h组进一步降低。此结果符合这一相关性趋势的表现。无明显相关性的原因可能与样本量较少及时间点的选择有关。关于HPA轴激素水平与脑组织细胞凋亡表达的研究,多集中在脑缺血后COR释放增加促进血浆糖皮质激素(glucocorticoids,GCS)含量增高,造成神经细胞损伤加重这一机制上。有学者认为,脑缺血后引发的血浆高GCS水平可加重脑缺血再灌注后的神经细胞死亡,高GCS诱导神经细胞死亡的主要形式是细胞凋亡。若早期给予能够降低或抑制GCS含量的药物,可能比单纯拮抗GCS生物学作用的药物有更大的应用价值。关于缺血后HPA轴水平与细胞凋亡表达的相关性,值得进一步探索和挖掘。
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在本实验中观察到,模型组大鼠CRH、ACTH含量均低于正常组,COR明显高于正常组,经地黄饮子灌胃后,可提高大鼠血浆CRH、ACTH含量,使其高于模型组,而COR则明显低于模型组,且差异有显著统计学意义。提示地黄饮子能够改善脑缺血大鼠HPA轴功能的紊乱状态,通过提高CRH含量抑制了大鼠体内COR的释放。这一结果支持了钟历勇、沈自尹等提出的补肾药可通过上调下丘脑CRFmRNA表达来保护HPA轴免受外源性皮质醇的抑制,补肾药对肾阳虚证的主要调节点定位于下丘脑的观点。现代医学研究认为,肾阳虚证与神经内分泌免疫系统(NEIS)有关,肾阳虚证在下丘脑-垂体-靶腺(肾上腺皮质、甲状腺、性腺和胸腺)轴不同环节、不同程度的功能紊乱,且主要发病环节在下丘脑(或更高级)的调节功能紊乱。中风病的病位在脑,脑与肾密切相关。肾虚既是其发病基础,又是病情发展过程中影响预后和病情轻重的关键因素。鉴于肾与脑的密切关系及肾虚在中风病因病机中的重要作用,在临床治疗时对急性期患者尽早采用补肾治疗以扶助正气,对帮助患者脑功能的恢复,减轻脑功能的损害具有重要的意义。
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实验三结果显示,模型组大鼠CRH、ACTH含量均低于正常组,COR明显高于正常组,经地黄饮子灌胃后,可提高大鼠血浆CRH、ACTH含量,使其高于模型组,而COR则明显低于模型组,差异有显著统计学意义。在本实验中,模型组ACTH含量与脑组织细胞凋亡表达的TUNEL染色结果存在显著负相关关系,但CRH、COR则与凋亡表达无明显相关性。说明模型组血浆ACTH含量低于中药组,则细胞凋亡表达较之更为明显。其余指标之间无明显相关性的原因可能与样本量偏少有一定的关系。HPA轴的紊乱程度与肾功能受损程度具有一致性,说明地黄饮子加减方能够通过改善HPA轴的紊乱状态发挥抑制细胞凋亡,发挥脑保护作用的目的。
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4 急性期内HSP70变化水平与预后的相关性
既往研究认为HSP70在脑缺血后的表达高峰期大约出现在第2-5天,约第7天之后开始下降,是细胞内重要的信号转导分子,并在免疫应答中发挥抗原呈递作用,HSP70的抗体参与了脑梗死的发病过程,并通过细胞免疫反应达到保护脑细胞的作用。本研究结果显示,发病60天、90天时的BI指数与急性期内HSP70变化水平并无明显相关性,说明在神经功能缺损程度较轻的这组患者当中,急性期内HSP70的变化水平不是能用于判断预后状态的特异性指标。患者的预后状态受到多种因素的影响,只用一种生物学指标来判断的话确实缺乏客观性和准确性。
5 总结与展望
本研究从脑肾相关理论出发,旨在探讨缺血性中风急性期补肾护脑法的生物学基础。中医理论之肾,是一个包括生殖、遗传、排泄、应激、免疫调节、内外腺体激素分泌、能量代谢等多种功能在内的综合系统。宏观脏器的“肾”实体与多种微观的“功能”系统构筑成一个网络功能态,这个网络与现代医学研究的以HPA轴为核心的NEI网络在功能调控方面有一定的类似之处及重合区。因此本研究在病证结合研究模式的指导思想下,以神经内分泌激素为切入点,初步探讨了它与中医证候、病机在生物学基础层面的关系,从一定程度上完善了缺血性中风病证结合的诊断标准,为建立早期运用补肾中药对缺血性中风患者预后影响的临床疗效评价体系提供了生物学指标依据,同时也为构建完整的中医脑病理论体系奠定了基础。
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