纤溶酶产生菌的发酵条件优化及酶学性质初探
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摘要
血栓性疾病是目前临床上死亡率最高的疾病之一，寻找高效、安全的溶血栓药物一直是世界医药行业关注的热点。溶栓疗法是这类疾病重要的治疗方法之一，由于现用溶栓药物或多或少都存在一些缺陷，因此人们一直都在研制开发新型的溶血栓药物。
本实验采用自行设计的筛选方法，从土壤中筛选分离到两株具有产高活性纤溶酶的优势菌株HFZ-1A和HFZ-2D，系统的优化了两菌株产纤溶酶的液体发酵条件(培养基、接种量、菌龄、pH、溶氧量、营养、时间、摇床转速等)，确定了最适液态发酵条件，对发酵液进行了初步的分离提纯，得到了粗酶M-1A和M-2D，初步研究了两种酶的酶学性质，纤溶作用方式和体外溶栓效果，并做了小白鼠灌胃M-1A和M-2D新鲜酶液的急性毒性试验。为进一步进行体内溶栓实验，开发成为新型溶栓类药物提供了有用的参数。
1．利用单因素实验和正交分析方法相结合，对HFZ-1A、HFZ-2D两菌株产纤溶酶液体发酵条件进行了优化，得出如下结果：
(1) HFZ-1A菌株最佳产酶条件为：在基础液体发酵培养基中添加可溶性淀粉4％，蛋白胨2％，柠檬酸铁铵0.1％，磷酸钙0.4％，十二烷基磺酸钠(SDS)0.1％，接种量2％，pH7.5，发酵时间96h，装瓶量75／500(mL／mL)，摇床温度37℃，转速150r／min。在该条件下所得的初级粗酶液10μL点种于纤维蛋白平板上37℃培养16h，最大溶圈面积可达583.71mm~2，根据标准曲线转换为尿激酶酶活最大酶活力可达581.81IU／mL。
(2) HFZ-2D菌株最佳产酶条件为：在基础液体发酵培养基中添加可溶性淀粉2％，尿素2％，柠檬酸铁铵0.4％，KH_2PO_40.1％，聚乙二醇(PEG)0.1％，接种量4％，pH7.5，发酵时间72h，装瓶量100／500(mL／mL)，摇床温度32℃，转速180r／min。在该条件下所得的初级粗酶液10μL点种于纤维蛋白平板上37℃培养16h，最大溶圈面积可达685.43mm~2，根据标准曲线转换为尿激酶酶活最大酶活力可达693.97IU／mL。
(3) 以上两菌株产酶活力与国内外同类研究相比，纤溶活性是比较高的。其中菌株FHZ-1A在其生长过程中产生橙红色色素，在国内外已报道的纤溶酶高产菌株中尚未见有产色素菌株的报道。
Thrombus is a kind of disease which leads to tip top death rate in clinic for the moment. Scientists of medicine vocation are always paying attention to searching of deliquescent thrombus medicament in the world. And people have been developing the novel medicine to this day.
The experiment had screened two superiority strains which named HFZ-1A and HFZ-2D that can produce the higher activity fibrinolytic enzyme.Fermentation conditions, including medium, inoculation quantity, strain age, pH, OD, rpm, had been optimized.Then, purified fibrinolytic enzyme named M-1 A and M-2D,studied prorerties of enzyme and dissolution of thrombolyic. Finally,observed the acute toxicity of M-1 A and M-2D on mouse.
1. Fermentation conditions of HFZ-1A and HFZ-2D were optimized through single factor test and orthogonal design study. The conclusion was as follows:
(1) HFZ-1A stain: soluble starch 4%,peptone 2%, ammonium ferric citrate 0.1%,calcium phosphate 0.4%,SDS 0.1%,the inoculum size 2%,pH 7.5, fermentation time 96 h,media amount 75/500 (mL/mL),fermentation temperature 37 °C, rotate speed 150 r/min.Under these conditions,the strain's fibrinolytic enzyme activity was 581.81 IU/mL.
(2) HFZ-2D stain: soluble starch2%, urea2%, ammonium ferric citrate0.4%, KH_2PO_40.1%, PEG 0.1%,the inoculum size 4%,pH7.5, fermentation time 72h,media amount 100/500(mL/mL),fermentation temperature32°C,rotate speed 180r/min.Under these conditions,the strain's fibrinolytic enzyme activity was 693.97 IU/mL.
(3) Compared to correlative study, fibrinolytic enzyme activity of HFZ-1 A and HFZ-2D strain is higher.
2. After purifying, enzyme activity of M-1A reached 1032.69 IU/mL and the activity of M-2D reached 1258.14 IU/mL.The characters of these two enzymes had been studied.The optimum pH and optimum temperature for M-1A and M-2D to dissolute thrombolyic are pH7.5~8.5 and 45°C~50°C,and theses two enzymes activities are not stable at high temperature and low pH, Fe~3、 Mn~2、 NH_4~+ activates the activaty of M-1 A and SO_4~(2-)、 Zn~(2+)、
本实验采用自行设计的筛选方法，从土壤中筛选分离到两株具有产高活性纤溶酶的优势菌株HFZ-1A和HFZ-2D，系统的优化了两菌株产纤溶酶的液体发酵条件(培养基、接种量、菌龄、pH、溶氧量、营养、时间、摇床转速等)，确定了最适液态发酵条件，对发酵液进行了初步的分离提纯，得到了粗酶M-1A和M-2D，初步研究了两种酶的酶学性质，纤溶作用方式和体外溶栓效果，并做了小白鼠灌胃M-1A和M-2D新鲜酶液的急性毒性试验。为进一步进行体内溶栓实验，开发成为新型溶栓类药物提供了有用的参数。
1．利用单因素实验和正交分析方法相结合，对HFZ-1A、HFZ-2D两菌株产纤溶酶液体发酵条件进行了优化，得出如下结果：
(1) HFZ-1A菌株最佳产酶条件为：在基础液体发酵培养基中添加可溶性淀粉4％，蛋白胨2％，柠檬酸铁铵0.1％，磷酸钙0.4％，十二烷基磺酸钠(SDS)0.1％，接种量2％，pH7.5，发酵时间96h，装瓶量75／500(mL／mL)，摇床温度37℃，转速150r／min。在该条件下所得的初级粗酶液10μL点种于纤维蛋白平板上37℃培养16h，最大溶圈面积可达583.71mm~2，根据标准曲线转换为尿激酶酶活最大酶活力可达581.81IU／mL。
(2) HFZ-2D菌株最佳产酶条件为：在基础液体发酵培养基中添加可溶性淀粉2％，尿素2％，柠檬酸铁铵0.4％，KH_2PO_40.1％，聚乙二醇(PEG)0.1％，接种量4％，pH7.5，发酵时间72h，装瓶量100／500(mL／mL)，摇床温度32℃，转速180r／min。在该条件下所得的初级粗酶液10μL点种于纤维蛋白平板上37℃培养16h，最大溶圈面积可达685.43mm~2，根据标准曲线转换为尿激酶酶活最大酶活力可达693.97IU／mL。
(3) 以上两菌株产酶活力与国内外同类研究相比，纤溶活性是比较高的。其中菌株FHZ-1A在其生长过程中产生橙红色色素，在国内外已报道的纤溶酶高产菌株中尚未见有产色素菌株的报道。
Thrombus is a kind of disease which leads to tip top death rate in clinic for the moment. Scientists of medicine vocation are always paying attention to searching of deliquescent thrombus medicament in the world. And people have been developing the novel medicine to this day.
The experiment had screened two superiority strains which named HFZ-1A and HFZ-2D that can produce the higher activity fibrinolytic enzyme.Fermentation conditions, including medium, inoculation quantity, strain age, pH, OD, rpm, had been optimized.Then, purified fibrinolytic enzyme named M-1 A and M-2D,studied prorerties of enzyme and dissolution of thrombolyic. Finally,observed the acute toxicity of M-1 A and M-2D on mouse.
1. Fermentation conditions of HFZ-1A and HFZ-2D were optimized through single factor test and orthogonal design study. The conclusion was as follows:
(1) HFZ-1A stain: soluble starch 4%,peptone 2%, ammonium ferric citrate 0.1%,calcium phosphate 0.4%,SDS 0.1%,the inoculum size 2%,pH 7.5, fermentation time 96 h,media amount 75/500 (mL/mL),fermentation temperature 37 °C, rotate speed 150 r/min.Under these conditions,the strain's fibrinolytic enzyme activity was 581.81 IU/mL.
(2) HFZ-2D stain: soluble starch2%, urea2%, ammonium ferric citrate0.4%, KH_2PO_40.1%, PEG 0.1%,the inoculum size 4%,pH7.5, fermentation time 72h,media amount 100/500(mL/mL),fermentation temperature32°C,rotate speed 180r/min.Under these conditions,the strain's fibrinolytic enzyme activity was 693.97 IU/mL.
(3) Compared to correlative study, fibrinolytic enzyme activity of HFZ-1 A and HFZ-2D strain is higher.
2. After purifying, enzyme activity of M-1A reached 1032.69 IU/mL and the activity of M-2D reached 1258.14 IU/mL.The characters of these two enzymes had been studied.The optimum pH and optimum temperature for M-1A and M-2D to dissolute thrombolyic are pH7.5~8.5 and 45°C~50°C,and theses two enzymes activities are not stable at high temperature and low pH, Fe~3、 Mn~2、 NH_4~+ activates the activaty of M-1 A and SO_4~(2-)、 Zn~(2+)、
引文
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