桂花切花花瓣衰老过程中的蛋白质变化分析
摘要
桂花(Osmanthus fragrans Lour)由于其特有的芳香而极具观赏性，在园林栽培中广泛运用。随着大花品种的出现，桂花已经成为一种极具发展潜力的切花资源，但由于桂花的花期较短，大大缩短了桂花切花的观赏期，成为其发展切花的限制条件。目前，利用遗传工程在分子水平上控制花瓣衰老，延长花期的花卉育种已经得到了长足的发展。本实验建立了厚瓣金桂(O. fragrans 'Houban Jingui')花瓣蛋白SDS-PAGE电泳实验体系，在蛋白质水平上对桂花切花衰老进行了研究。为桂花的遗传育种提供一些研究信息。
本试验研究结果如下：
1．蛋白电泳样品提取方法的确定。经过研究比较和改进，最后得到改良的丙酮沉淀法。利用该方法提取的蛋白样品得到的电泳结果杂质干扰少，蛋白带清晰且条带数较多。
2．桂花花瓣蛋白SDS-PAGE实验体系的建立。通过比较电泳结果调整分离胶浓度为11％，长度为10-11cm；浓缩胶浓度为3.9％，长度为1.5-2cm；样品上样量10μl，点样孔10×2.5×1mm~3；电泳时间2.5h左右，利用比较后选择的染色方法染色凝胶，得到了背景色浅、蛋白带清晰的凝胶图谱。在此基础上还对花瓣蛋白的双向电泳进行了初步试验。本试验还对单向SDS-PAGE结果图谱用2D软件包进行了分析，得到的蛋白质信息量比常规分析方法得到的要全面。
3．对切花花瓣衰老过程中蛋白的SDS-PAGE结果进行了分析，结果表明，39.8kD和27.5 kD多肽的表达水平从瓶插开始到结束蛋白条带基本保持稳定；37.6 kD多肽的表达水平随花瓣衰老而逐渐减弱：63.1kD、57.5 kD、51.5 kD多肽是随着花瓣的衰老而出现，且表达水平与花瓣的程度衰老成正比。对切花进行乙烯和ABA促衰处理导致51.5 kD和32.3 kD多肽的不同变化，说明这些多肽可能与它们引起衰老的不同机理有关。
Osmanthus ( Osmanthus fragrans Lour.) is one of the traditional ornamental flower and is wildely used in gardens because of its specific fragrance .With the breed of large-flower varieties, osmanthus has become a kind of cut flower resource with good developing prospect. But osmanthus ornamental period is shortened by its short florescence, and this limits its development as cut flower. Nowadays, controlling the senescence of petal to prolong florescence by genetic engineering has obtained great development. This experiment established the SDS-PAGE experimental system for proteins of petal from osmanthus(O. fragrans 'Houban Jingui'), and studied the senescence of petal of osmanthus in protein level, which will bring some information for osmanthus genetic breed.
The main results in this experiment were shown as follows:
1. The determination of protein extraction method for electrophoresis. Based on studying and comparing other methods, an improved acetone-sediment method was achieved. By this method, the results of SDS-PAGE had clear protein bands with little background.
2. Establishment of SDS-PAGE experimental system for petal proteins of osmanthus. After comparing the results of electrophoresis, the conditions of electrophoresis were modified : concentration of running gel was 11% with length of 9-10cm .the concentration of stacking gel was 3.9% with 1.5-2.0cm, the amount of added protein samples were 10ul in the vents of 10 X 2.5 X 1mm3, the running time was 2.5 hours or so. and gels were stained with the protocol selected from several staining methods. The proteins bands were clear and its background was low in the results of electrophoresis. Based on this, some preliminary study on 2-Dimensional electrophoresis for proteins of petal was carried out.
3. The results of SDS-PAGE of proteins during senescent petal of cut osmanthus. The experiment analysis showed: 39. 8 kD and 27.5 kD peptides were stable from beginning to the end, 37.6 kD peptide decreased gradually and 63. 1kD, 57. 5 kD, 51.5 kD peptides appeared and increased with the senescence of petal. 51.5 kD, 32.3 kD paptides changed after ethylene and ABA treatment. This implies that there is some relationship between changes of peptides and senescence of petal.
本试验研究结果如下：
1．蛋白电泳样品提取方法的确定。经过研究比较和改进，最后得到改良的丙酮沉淀法。利用该方法提取的蛋白样品得到的电泳结果杂质干扰少，蛋白带清晰且条带数较多。
2．桂花花瓣蛋白SDS-PAGE实验体系的建立。通过比较电泳结果调整分离胶浓度为11％，长度为10-11cm；浓缩胶浓度为3.9％，长度为1.5-2cm；样品上样量10μl，点样孔10×2.5×1mm~3；电泳时间2.5h左右，利用比较后选择的染色方法染色凝胶，得到了背景色浅、蛋白带清晰的凝胶图谱。在此基础上还对花瓣蛋白的双向电泳进行了初步试验。本试验还对单向SDS-PAGE结果图谱用2D软件包进行了分析，得到的蛋白质信息量比常规分析方法得到的要全面。
3．对切花花瓣衰老过程中蛋白的SDS-PAGE结果进行了分析，结果表明，39.8kD和27.5 kD多肽的表达水平从瓶插开始到结束蛋白条带基本保持稳定；37.6 kD多肽的表达水平随花瓣衰老而逐渐减弱：63.1kD、57.5 kD、51.5 kD多肽是随着花瓣的衰老而出现，且表达水平与花瓣的程度衰老成正比。对切花进行乙烯和ABA促衰处理导致51.5 kD和32.3 kD多肽的不同变化，说明这些多肽可能与它们引起衰老的不同机理有关。
Osmanthus ( Osmanthus fragrans Lour.) is one of the traditional ornamental flower and is wildely used in gardens because of its specific fragrance .With the breed of large-flower varieties, osmanthus has become a kind of cut flower resource with good developing prospect. But osmanthus ornamental period is shortened by its short florescence, and this limits its development as cut flower. Nowadays, controlling the senescence of petal to prolong florescence by genetic engineering has obtained great development. This experiment established the SDS-PAGE experimental system for proteins of petal from osmanthus(O. fragrans 'Houban Jingui'), and studied the senescence of petal of osmanthus in protein level, which will bring some information for osmanthus genetic breed.
The main results in this experiment were shown as follows:
1. The determination of protein extraction method for electrophoresis. Based on studying and comparing other methods, an improved acetone-sediment method was achieved. By this method, the results of SDS-PAGE had clear protein bands with little background.
2. Establishment of SDS-PAGE experimental system for petal proteins of osmanthus. After comparing the results of electrophoresis, the conditions of electrophoresis were modified : concentration of running gel was 11% with length of 9-10cm .the concentration of stacking gel was 3.9% with 1.5-2.0cm, the amount of added protein samples were 10ul in the vents of 10 X 2.5 X 1mm3, the running time was 2.5 hours or so. and gels were stained with the protocol selected from several staining methods. The proteins bands were clear and its background was low in the results of electrophoresis. Based on this, some preliminary study on 2-Dimensional electrophoresis for proteins of petal was carried out.
3. The results of SDS-PAGE of proteins during senescent petal of cut osmanthus. The experiment analysis showed: 39. 8 kD and 27.5 kD peptides were stable from beginning to the end, 37.6 kD peptide decreased gradually and 63. 1kD, 57. 5 kD, 51.5 kD peptides appeared and increased with the senescence of petal. 51.5 kD, 32.3 kD paptides changed after ethylene and ABA treatment. This implies that there is some relationship between changes of peptides and senescence of petal.
引文
1．丁勤学，郭尧君，景书谦等．成年和老年小鼠脑蛋白质组双向电泳图谱比较．生物化学与生物物理进展，2001，28(5)：683-687
2．万晶宏等．科学通报，1999，44：904
3．于玲．何丽霞，李嘉珏，成仿云．牡丹野生种间蛋白质谱带的比较研究。园艺学报．1998，25(1)：99-101
4．马瑞君，李常宝，刘艳玲，廉永善．四种沙棘种子可溶性蛋白谱带分析研究。沙棘，10(3)：4-10
5．王台．一种适用于双向电泳凝胶的染色方法．植物学通报，1996，13(4)：56-57
6．王然，王成荣，罗松，韩碧文．月季花瓣衰老过程中可溶性蛋白的SDS-PAGE分析．园艺学报，1998，25(3)：306-307．
7．王大勇，高云飞，崔克明，翟中和．植物细胞质中存在类Fas死亡因子的试验证据．科学通报，2002，47(3)：211-215
8．王玉忠，邵继荣．刘永胜，余金洪等．温敏失绿突变体水稻1103s在失绿过程中全叶蛋白的变化．植物学报，1999，41(5)：519-523
9．王吉村，药立波．赵忠良．筛选差异表达基因和蛋白质的方法进展．生物化学与生物物理进展，2001，28(1)：33-36
10．王延峰．乙烯、自由基、影M向花的衰老的研究进展．延安大学学报(自然科学版)，1998，17(3)：77-80
11．王振英，彭永康，陈宏．甩双向电泳分析百合减数第一分裂周期蛋白质的变化．植物研究，2001，21(4)：596-599
12．王彩云，高莉萍，鲁涤非，黄燕文．“厚瓣金桂”桂花花芽形态分化的研究．园艺学报，2002．29(1)：52-56
13．王景升 王玺 刘国奇 王有福．电泳谱带法在作物品种纯度鉴定上的应用研究．沈阳农业大学学报，1996，27(3)：221-225
14．司智海，刘植义．普通小麦线粒体蛋白质的双向电泳分析．生物化学与生物物理进展，1990．17(1)：67-69
15．伍泽堂．超氧自由基与叶片衰老时叶绿素破坏的关系．植物生理学通讯，1991．27(4)：277-279
16．刘昌文，丁志祥，程昌文．柑桔属叶片酯酶同工酶和蛋白质电泳分析。西南农业学报．1997，10(4)：70-74
17．吕秀华，娄维义，党永岩，柴魏君，许立春．电泳技术的发展和应用．农业与技术．2001，21(3)：43-45
18．孙之荣．赵晓鹏．蛋白质双向电泳图谱的计算机处理和数量化分析．生物物理学报，1989，5(4)：397-401
19．孙闺芳．钝叶决明子、决明子、望江南子的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别。天津药学，1996，8(3)：：69-72。
20．臼书农，潭克解．湖北光敏核不育水稻农农垦5 8 S叶片60kDa蛋白特异性及其功能的讨论[J]．植物学报，1997．39(2)：189—192
21．阮禹松，段淑娥．赵文明．种子蛋白质亚基结构快速测定双向电泳法．西北植物学报，2001．21(1)：175-179
22．何大澄．肖雪媛．差异蛋白质组学及其应用．北京师范大学学报(自然科学版)，2002，38(4)：558—162
23．何瑞锋，丁毅．张剑锋，余金洪．植物叶片蛋白质双向电泳技术的改进和优化．遗传，2000．22(5)：319-321
24．吴有梅，顾采琴，刘愚等．ABA和乙烯在草莓采后成熟衰老中的作用．植物生理学报，1992，18：167-172
25．张蒙．贾新成，陈明杰．草菇低温诱导蛋白研究初探．菌物系统，2000，19(4)：580-582
26．张元宝．用电泳法分析芸薹属三种作物蛋白质研究。安徽农学通报，1999，5(1)：29-31
27．张鲁刚，柯挂兰．大白菜胞质雄性不育系和保持系同工酶及可溶性蛋白质分析。西北农业学报，1999，8(4)：67-70
28．李凤玉，梁海曼．PP_(333)脉冲处理黄瓜去顶苗对成花和POD同工酶及可溶性蛋白质的影响．浙江大学学报(农业与生命科学版)．2001，27(4)：385-389
29．李合生主编．植物生理生化试验原理和技术．高等教育出版社，2000：164-185
30．李家义等译．国际种子检验规程．上海：上海科技出版社，1995．270-295
31．孟繁静主编．植物花发育的分子生物学．中国农业出版社，2000：309-310
32．杨继华，颜承．薛妙男，秦新民．沙田袖花粉蛋白质双向电泳分析．广西师范大学学报(自然科学版)，200220(2)：73-77
33．沈成国等．植物衰老生理与分子生物学．中国农业出版社，2001：14
34．谷瑞升，蒋湘宁．一种省时高效的木本植物蛋白双向电泳分析方法．北京林业大学学报．1999a，21(5)：7—10
35．谷瑞升，刘群录，陈雪梅，蒋湘宁．木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比较和优化．植物学报，1999b，16(2)：171-177
36．陆定志．傅家瑞，宋松泉．植物衰老及其调控．中国农业出版社．1997．242-243
37．陈伟．顽拗植物荔枝蛋白质双向电泳的改良方法。福建农业大学学报，2001，30(1)：123-12
38．陈丹华．蛋白质、凝胶电泳及其分析应用．分折科学学报，1995，11(3)：75-86
39．陈昆松，徐昌杰，楼健等．脂氧合酶与猕猴桃果实后软化的关系．植物生理学报，1999，25(2)：138-144
40．周毅，尤忠胜，愈越汉，张惟杰．化学药剂对唐菖蒲切花衰老的影响．园艺学报．1994，21(2)：189-192
41．周相娟，姜微波，赵玉梅，刘鹏程．香菜叶片衰老相关63KD蛋白酶的分析鉴定．科学通报，2002，47(9)：693-696
42．周莜玲．6-BA对棍子切花衰老影响的研究．九江师专学报(自然科学版)，1999．18(3)：32-34
43．季玉鸣等．盐适应和非盐适应烟草愈伤组织蛋白组分分析．植物生理学通报，1991，17(1)：56-62
44．林全 曹宗．黄瓜器官特异蛋白的研究．植物学报，1996，38(7)：525-529
45．罗云波．果蔬采后生理技术研究进展．园艺学年评．北京：科学出版社，1995：39-56
46．罗云波．刘先舜．乙烯诱导下草莓果实采后RNA代谢与蛋白质合成活性的变化．植物生理学报，1994．20(3)：235-239
47．郑秀敏等．保鲜剂组分对蕾期采收菊花水分平衡、品质及瓶插寿命之影响[J]．中国园艺．1983，29(1)：53-63
48．姜微波，Shimon Mayak，Abraham H．Halevy．香石竹花瓣中乙烯诱导合成的60kD蛋白功能的初步研究．植物学报，1999，41(10)：1139-1141
49．姜微波．Shimon Mayak，Abraham H．Halevy．香石竹花瓣对乙烯的敏感性与蛋白质合成．植物学报，1997b，39(11)：991-997
50．姜微波，Shimon Mayak，Abraham H．Halevy．香石竹花瓣衰老过程中的蛋白质降解．园艺学报，1997a，24(4)：369-372
51．姜微波，孙自然．于梁．采收时花序的发育程度对唐菖蒲切花的影响．植物生理学通讯，1988，5：180-184
52．洪发水，赵海泉．CaC12对月季切花衰老的影响．园艺学报，1999．26(1)：62-64
53．赵军，赵玉田，梁博文．寒胁迫过程中冬小麦叶片组织可溶性蛋白质含量的变化和功能．中国农业科学，1994，27(2)：57-61
54．贾宇峰．林秋霞，郭尧君等．蛋白质双向电泳图像分析．生物化学与生物物理进展，2001，28(2)：246-250
55．郭尧君．蛋白质实验技术．科学出版社．1999：123
56．郭维明．盛爱武．梅花采后衰老的内源激素调节．北京林业大学学报．1999，21(2)：42-47
57．郭维明，章志红，房伟民．6-BA对切花菊瓶插期间生理效应的调节．园艺学报，1997，24(4)：364-368
58．钱前．杨伟，黄大年．杨长登等．水稻白绿苗的可溶性蛋白质电泳分析．中国水稻科学，1991，5(4)：183-185
59．高勇等．切花保鲜剂研究综述[J]．园艺学报，1989，16(2)：139-145．
60．高勇等．月季切花瓶插期生理变化与衰老关系的研究[J]．园艺学报．1990，17(1)：71-75
61．梁明山 刘熠，候留记 李霞．聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定烟草品种。种子，2001，1：
62．盛爱武．郭维明，孙志华．腊梅切花内源激素动态与衰老有关因子的研究．北京林业大学学报．1999，21(2)：48-53
63．逯斌，林兵．一种改良的植物蛋白质双向电泳方法[J]．生物化学与生物物理进展，1989．16(6)：480-481
64．龚本海．郭燕舞，姚崇怀．泡桐属植物SOD同工酶和可溶性蛋白质分析。华中农业大学学报．，1994．13(5)：507-510，
65．葛淑君，程时，仲崇霞．侯琳．锌7-金属硫蛋白与镉7-金属硫蛋白抗羟自由基保护线粒体效应．生物化学与生物物理学报，1998，30(3)：267-271
66．解建勋，蒲小平．李玉珍，李长龄．蛋白质组分析技术进展．生物物理学报，2001．17(1)：19-26
67．詹显全．陈主初．蛋白质组中蛋白质鉴定技术的研究近况．国外医学分子生物学分册，2002，24(3)：129-133
68．樊建，陈朝银．赵声兰．余旭亚．核桃花蛋白质提取条件的初步研究．西南农业大学学报，2000．22(3)：246-248
69. Abbott A. How to spot a protein in a crowd[J].Nature,1999,402(6763):716-717
70. Baumgartner, B., Kende,H..and Matile,P.. Ribonuclease in senescing morning glory. Plant Physiol., 1975.55:734-73
71. Brady C J. Nucleic acid and protein synthesis. In: Nooden L D and Leopold A C eds. Senescence and Aging in Plants. New York:Academic Press, 1988a,55-79
72. Brady, C.J, Nucleic acid and protein synthesis. In: Nooden L.D. and Leopold A.C. eds. Senescence and Aging in Plants. New York: Academic Press, Inc.1988b: 147-179
73. Drake R.John I.Farrel A.et al. Isolation and analysis of cDNAs encoding tomato cysteine proteases expressed during leaf senescence. Plant Mol.Biol.,1996. 30:755-767
74. Eisinger W. Role of cytokinins in carnation flower senescence. Crop Prod, 1977,12:133-135
75. Ellis,J.R.S.etal.The indentification of UK wheat varieties by starch gel electrophoresis of gliad in proteins. Journal of the National Institute Agriculture Botany, 1977,14:221-231
76. Eze J M, Mayak S, Thomson J E et al. Senescence in cut carnation flowers: temporal and physiological relationships among water status, ethylene, ABA and membrane permeability. Physiol. Plant., 1986,68:323-328
77. Gans Amasino R M. Inhibition of leaf senescence by outoregulated production of cytokinin.Science., 1995,270:1986-1988
78. Gershon D, Effect of age on enzymic activity and protein turnover, Age, 1985,87:9
79. Gianazza. Isoelectric focusing [M]. Pharmacia Fine Chemical AB,1982
80. Greenburg J T.Programmed cell death: a way of life foe plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996,93:12094-12097
81. Guerrero C. de la Calle M. Reid M S.et aL. Analysis of the expression of two thiolprotease genes from daylily (Hemerocallis spp) daring flower senescence. Plant Mol.Biol.,1998. 36:565-575
82. Halevy A H,Mayak S. Senescence and postharvest physiology of cut flowers. Hort. Rev.,1981,3:59-143
83. Harman D, The free-radical theory of ageing ,In: Pryor WA ed, Free Radicals in Biology Vol.Ⅴ, Academic Press,London, 1982,255-266
84. Jiang W B.Mayak S,Halevy A H. Regulation of a petal-specific ethylene-induced 70KD protein from carnation. Physiol. Plant, 1994, 92:219-226
85. Jiang W B, Mayak S, Weiss D, Halevy A H. Responses to ethylene of carnation flowers and protein synthesis. Acta Bot.Sin. 1997c.39:991-997
86. Keough T. Youngquist R.S. Lacey M.P. A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted /user adsorption ionization mass spectrometry[J].Proc. Natl. Acad. Sci.,1999,96:7131-7136
87. Klose J, Kobalz U.2-DE of proteins: an updated protocol and implication for a functional analysis of the genome [J].Electrophoresis, 1995,16:1034-1059
88. Kondo S,Masuda E, Inone K..Relation between ABA application and fruit quality of 'Pionnier' grape. Acta. Hort., 1998, 464:35-40
89. Nagata S.Golstein P. The Fas death factor.Science., 1995,267:1449-1456
90. Nakagawa H. Ikl K. Hirata M .et al.. Inactive β-fructofuranosidase molecules in senescent tomato fruit. Phytochem.. 1980,19:195-198
91. Pennell R I. Lamb C. Programmed cell death in plants. The plant cell,1997,9:1157-1168
92. Rondey B. Jones. Margr E T, Pe Serek. Chen-Lan Kuo, et al.. The effect of protein synthesis inhibition on petal senescence in cut bud flower. J. Amex. Soc. Hort. Sci., 1994, 119(6): 1243-1247
93. Rosen H, Matto A K, Suttle J C. The plant Hormone Ethylene. Frolida: CRC Press,1991,121-173
94. Steinberg T.H. ,Haugland R.P., Singer V.L., Application of SYPRO orange and SYPRO protein gel stain[J].Analytical Biochemistry, 1996,239:238-245
95. Valpuesta V, Lang N E. Guerrero C, et al. Up-regulation of a cyateine protease accompanies the ethylene-insensitive senescence od daylily flower.PMB,1995,28:575-582
96. Whitelegge J.P.Coutre J.Le.Lee J.C.,et al. Toward the bilayer proteome, electrospray ionization-mass spectrometry of large, intact trans-membrane protein[J].Proc. Natl. Acad. Sci.. 1999.96:10695-10698
97. Woffenden B J, Freeman T B, Beer E P. Proteasome inhibitors prevent tracheary element differentiation in Zinnia mesophyll cell cultures. Plant Physiology, 1998, 118:419-430
98. Woodson W R.Handa A K. Changes in protein patterns and in vivo protein synthesis during presenescence and senescence of hibiscus petal. J. Plant Physiol.,1957b,128:67-75
99. Woodson W R. Changes in protein and mRNA population during the senescence of carnation petal. Physiol. Plant., 1987a,71:495-502
100. Woodson W R, Park K Y, Drory A, et al. Expression of ethylene biosynthesic pathway transcripts in senescing carnation flowers. Plant Physiol. 1992, 99:526-532
101. Wrigley C.W. Single-seed identification of wheat varieties: use of grain hardness testing. electrophoretic analysis and a rapid test paper for phenol reaction. Journal of the Science of food and agriculture, 1976,27(5):429-432
102. Wulster, G..Sacalis, J. and Janes, H.W..The effects of protein synthesis on ethylene-induced senescence in isolated carnation petal. J. Am. Soc. Hortic. Sci. ,1982.17:112-115
103. Wulster, G..Sacalis, J. and Janes, H. W.. Senescence in isolated carnation petal. Plant Physiol. ,1982.7.: 1039-1043.
104. Yao X. Khosravi-Far R. Chang H W. et al. Daxx : a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis.Cell, 1997,89:1067-1076
105. Yen C H, Yang C H. Evidence for programmed cell death during leaf senescence in plants. Plant cell Physiology, 1998,39(9):922-927
2．万晶宏等．科学通报，1999，44：904
3．于玲．何丽霞，李嘉珏，成仿云．牡丹野生种间蛋白质谱带的比较研究。园艺学报．1998，25(1)：99-101
4．马瑞君，李常宝，刘艳玲，廉永善．四种沙棘种子可溶性蛋白谱带分析研究。沙棘，10(3)：4-10
5．王台．一种适用于双向电泳凝胶的染色方法．植物学通报，1996，13(4)：56-57
6．王然，王成荣，罗松，韩碧文．月季花瓣衰老过程中可溶性蛋白的SDS-PAGE分析．园艺学报，1998，25(3)：306-307．
7．王大勇，高云飞，崔克明，翟中和．植物细胞质中存在类Fas死亡因子的试验证据．科学通报，2002，47(3)：211-215
8．王玉忠，邵继荣．刘永胜，余金洪等．温敏失绿突变体水稻1103s在失绿过程中全叶蛋白的变化．植物学报，1999，41(5)：519-523
9．王吉村，药立波．赵忠良．筛选差异表达基因和蛋白质的方法进展．生物化学与生物物理进展，2001，28(1)：33-36
10．王延峰．乙烯、自由基、影M向花的衰老的研究进展．延安大学学报(自然科学版)，1998，17(3)：77-80
11．王振英，彭永康，陈宏．甩双向电泳分析百合减数第一分裂周期蛋白质的变化．植物研究，2001，21(4)：596-599
12．王彩云，高莉萍，鲁涤非，黄燕文．“厚瓣金桂”桂花花芽形态分化的研究．园艺学报，2002．29(1)：52-56
13．王景升 王玺 刘国奇 王有福．电泳谱带法在作物品种纯度鉴定上的应用研究．沈阳农业大学学报，1996，27(3)：221-225
14．司智海，刘植义．普通小麦线粒体蛋白质的双向电泳分析．生物化学与生物物理进展，1990．17(1)：67-69
15．伍泽堂．超氧自由基与叶片衰老时叶绿素破坏的关系．植物生理学通讯，1991．27(4)：277-279
16．刘昌文，丁志祥，程昌文．柑桔属叶片酯酶同工酶和蛋白质电泳分析。西南农业学报．1997，10(4)：70-74
17．吕秀华，娄维义，党永岩，柴魏君，许立春．电泳技术的发展和应用．农业与技术．2001，21(3)：43-45
18．孙之荣．赵晓鹏．蛋白质双向电泳图谱的计算机处理和数量化分析．生物物理学报，1989，5(4)：397-401
19．孙闺芳．钝叶决明子、决明子、望江南子的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别。天津药学，1996，8(3)：：69-72。
20．臼书农，潭克解．湖北光敏核不育水稻农农垦5 8 S叶片60kDa蛋白特异性及其功能的讨论[J]．植物学报，1997．39(2)：189—192
21．阮禹松，段淑娥．赵文明．种子蛋白质亚基结构快速测定双向电泳法．西北植物学报，2001．21(1)：175-179
22．何大澄．肖雪媛．差异蛋白质组学及其应用．北京师范大学学报(自然科学版)，2002，38(4)：558—162
23．何瑞锋，丁毅．张剑锋，余金洪．植物叶片蛋白质双向电泳技术的改进和优化．遗传，2000．22(5)：319-321
24．吴有梅，顾采琴，刘愚等．ABA和乙烯在草莓采后成熟衰老中的作用．植物生理学报，1992，18：167-172
25．张蒙．贾新成，陈明杰．草菇低温诱导蛋白研究初探．菌物系统，2000，19(4)：580-582
26．张元宝．用电泳法分析芸薹属三种作物蛋白质研究。安徽农学通报，1999，5(1)：29-31
27．张鲁刚，柯挂兰．大白菜胞质雄性不育系和保持系同工酶及可溶性蛋白质分析。西北农业学报，1999，8(4)：67-70
28．李凤玉，梁海曼．PP_(333)脉冲处理黄瓜去顶苗对成花和POD同工酶及可溶性蛋白质的影响．浙江大学学报(农业与生命科学版)．2001，27(4)：385-389
29．李合生主编．植物生理生化试验原理和技术．高等教育出版社，2000：164-185
30．李家义等译．国际种子检验规程．上海：上海科技出版社，1995．270-295
31．孟繁静主编．植物花发育的分子生物学．中国农业出版社，2000：309-310
32．杨继华，颜承．薛妙男，秦新民．沙田袖花粉蛋白质双向电泳分析．广西师范大学学报(自然科学版)，200220(2)：73-77
33．沈成国等．植物衰老生理与分子生物学．中国农业出版社，2001：14
34．谷瑞升，蒋湘宁．一种省时高效的木本植物蛋白双向电泳分析方法．北京林业大学学报．1999a，21(5)：7—10
35．谷瑞升，刘群录，陈雪梅，蒋湘宁．木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比较和优化．植物学报，1999b，16(2)：171-177
36．陆定志．傅家瑞，宋松泉．植物衰老及其调控．中国农业出版社．1997．242-243
37．陈伟．顽拗植物荔枝蛋白质双向电泳的改良方法。福建农业大学学报，2001，30(1)：123-12
38．陈丹华．蛋白质、凝胶电泳及其分析应用．分折科学学报，1995，11(3)：75-86
39．陈昆松，徐昌杰，楼健等．脂氧合酶与猕猴桃果实后软化的关系．植物生理学报，1999，25(2)：138-144
40．周毅，尤忠胜，愈越汉，张惟杰．化学药剂对唐菖蒲切花衰老的影响．园艺学报．1994，21(2)：189-192
41．周相娟，姜微波，赵玉梅，刘鹏程．香菜叶片衰老相关63KD蛋白酶的分析鉴定．科学通报，2002，47(9)：693-696
42．周莜玲．6-BA对棍子切花衰老影响的研究．九江师专学报(自然科学版)，1999．18(3)：32-34
43．季玉鸣等．盐适应和非盐适应烟草愈伤组织蛋白组分分析．植物生理学通报，1991，17(1)：56-62
44．林全 曹宗．黄瓜器官特异蛋白的研究．植物学报，1996，38(7)：525-529
45．罗云波．果蔬采后生理技术研究进展．园艺学年评．北京：科学出版社，1995：39-56
46．罗云波．刘先舜．乙烯诱导下草莓果实采后RNA代谢与蛋白质合成活性的变化．植物生理学报，1994．20(3)：235-239
47．郑秀敏等．保鲜剂组分对蕾期采收菊花水分平衡、品质及瓶插寿命之影响[J]．中国园艺．1983，29(1)：53-63
48．姜微波，Shimon Mayak，Abraham H．Halevy．香石竹花瓣中乙烯诱导合成的60kD蛋白功能的初步研究．植物学报，1999，41(10)：1139-1141
49．姜微波．Shimon Mayak，Abraham H．Halevy．香石竹花瓣对乙烯的敏感性与蛋白质合成．植物学报，1997b，39(11)：991-997
50．姜微波，Shimon Mayak，Abraham H．Halevy．香石竹花瓣衰老过程中的蛋白质降解．园艺学报，1997a，24(4)：369-372
51．姜微波，孙自然．于梁．采收时花序的发育程度对唐菖蒲切花的影响．植物生理学通讯，1988，5：180-184
52．洪发水，赵海泉．CaC12对月季切花衰老的影响．园艺学报，1999．26(1)：62-64
53．赵军，赵玉田，梁博文．寒胁迫过程中冬小麦叶片组织可溶性蛋白质含量的变化和功能．中国农业科学，1994，27(2)：57-61
54．贾宇峰．林秋霞，郭尧君等．蛋白质双向电泳图像分析．生物化学与生物物理进展，2001，28(2)：246-250
55．郭尧君．蛋白质实验技术．科学出版社．1999：123
56．郭维明．盛爱武．梅花采后衰老的内源激素调节．北京林业大学学报．1999，21(2)：42-47
57．郭维明，章志红，房伟民．6-BA对切花菊瓶插期间生理效应的调节．园艺学报，1997，24(4)：364-368
58．钱前．杨伟，黄大年．杨长登等．水稻白绿苗的可溶性蛋白质电泳分析．中国水稻科学，1991，5(4)：183-185
59．高勇等．切花保鲜剂研究综述[J]．园艺学报，1989，16(2)：139-145．
60．高勇等．月季切花瓶插期生理变化与衰老关系的研究[J]．园艺学报．1990，17(1)：71-75
61．梁明山 刘熠，候留记 李霞．聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定烟草品种。种子，2001，1：
62．盛爱武．郭维明，孙志华．腊梅切花内源激素动态与衰老有关因子的研究．北京林业大学学报．1999，21(2)：48-53
63．逯斌，林兵．一种改良的植物蛋白质双向电泳方法[J]．生物化学与生物物理进展，1989．16(6)：480-481
64．龚本海．郭燕舞，姚崇怀．泡桐属植物SOD同工酶和可溶性蛋白质分析。华中农业大学学报．，1994．13(5)：507-510，
65．葛淑君，程时，仲崇霞．侯琳．锌7-金属硫蛋白与镉7-金属硫蛋白抗羟自由基保护线粒体效应．生物化学与生物物理学报，1998，30(3)：267-271
66．解建勋，蒲小平．李玉珍，李长龄．蛋白质组分析技术进展．生物物理学报，2001．17(1)：19-26
67．詹显全．陈主初．蛋白质组中蛋白质鉴定技术的研究近况．国外医学分子生物学分册，2002，24(3)：129-133
68．樊建，陈朝银．赵声兰．余旭亚．核桃花蛋白质提取条件的初步研究．西南农业大学学报，2000．22(3)：246-248
69. Abbott A. How to spot a protein in a crowd[J].Nature,1999,402(6763):716-717
70. Baumgartner, B., Kende,H..and Matile,P.. Ribonuclease in senescing morning glory. Plant Physiol., 1975.55:734-73
71. Brady C J. Nucleic acid and protein synthesis. In: Nooden L D and Leopold A C eds. Senescence and Aging in Plants. New York:Academic Press, 1988a,55-79
72. Brady, C.J, Nucleic acid and protein synthesis. In: Nooden L.D. and Leopold A.C. eds. Senescence and Aging in Plants. New York: Academic Press, Inc.1988b: 147-179
73. Drake R.John I.Farrel A.et al. Isolation and analysis of cDNAs encoding tomato cysteine proteases expressed during leaf senescence. Plant Mol.Biol.,1996. 30:755-767
74. Eisinger W. Role of cytokinins in carnation flower senescence. Crop Prod, 1977,12:133-135
75. Ellis,J.R.S.etal.The indentification of UK wheat varieties by starch gel electrophoresis of gliad in proteins. Journal of the National Institute Agriculture Botany, 1977,14:221-231
76. Eze J M, Mayak S, Thomson J E et al. Senescence in cut carnation flowers: temporal and physiological relationships among water status, ethylene, ABA and membrane permeability. Physiol. Plant., 1986,68:323-328
77. Gans Amasino R M. Inhibition of leaf senescence by outoregulated production of cytokinin.Science., 1995,270:1986-1988
78. Gershon D, Effect of age on enzymic activity and protein turnover, Age, 1985,87:9
79. Gianazza. Isoelectric focusing [M]. Pharmacia Fine Chemical AB,1982
80. Greenburg J T.Programmed cell death: a way of life foe plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996,93:12094-12097
81. Guerrero C. de la Calle M. Reid M S.et aL. Analysis of the expression of two thiolprotease genes from daylily (Hemerocallis spp) daring flower senescence. Plant Mol.Biol.,1998. 36:565-575
82. Halevy A H,Mayak S. Senescence and postharvest physiology of cut flowers. Hort. Rev.,1981,3:59-143
83. Harman D, The free-radical theory of ageing ,In: Pryor WA ed, Free Radicals in Biology Vol.Ⅴ, Academic Press,London, 1982,255-266
84. Jiang W B.Mayak S,Halevy A H. Regulation of a petal-specific ethylene-induced 70KD protein from carnation. Physiol. Plant, 1994, 92:219-226
85. Jiang W B, Mayak S, Weiss D, Halevy A H. Responses to ethylene of carnation flowers and protein synthesis. Acta Bot.Sin. 1997c.39:991-997
86. Keough T. Youngquist R.S. Lacey M.P. A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted /user adsorption ionization mass spectrometry[J].Proc. Natl. Acad. Sci.,1999,96:7131-7136
87. Klose J, Kobalz U.2-DE of proteins: an updated protocol and implication for a functional analysis of the genome [J].Electrophoresis, 1995,16:1034-1059
88. Kondo S,Masuda E, Inone K..Relation between ABA application and fruit quality of 'Pionnier' grape. Acta. Hort., 1998, 464:35-40
89. Nagata S.Golstein P. The Fas death factor.Science., 1995,267:1449-1456
90. Nakagawa H. Ikl K. Hirata M .et al.. Inactive β-fructofuranosidase molecules in senescent tomato fruit. Phytochem.. 1980,19:195-198
91. Pennell R I. Lamb C. Programmed cell death in plants. The plant cell,1997,9:1157-1168
92. Rondey B. Jones. Margr E T, Pe Serek. Chen-Lan Kuo, et al.. The effect of protein synthesis inhibition on petal senescence in cut bud flower. J. Amex. Soc. Hort. Sci., 1994, 119(6): 1243-1247
93. Rosen H, Matto A K, Suttle J C. The plant Hormone Ethylene. Frolida: CRC Press,1991,121-173
94. Steinberg T.H. ,Haugland R.P., Singer V.L., Application of SYPRO orange and SYPRO protein gel stain[J].Analytical Biochemistry, 1996,239:238-245
95. Valpuesta V, Lang N E. Guerrero C, et al. Up-regulation of a cyateine protease accompanies the ethylene-insensitive senescence od daylily flower.PMB,1995,28:575-582
96. Whitelegge J.P.Coutre J.Le.Lee J.C.,et al. Toward the bilayer proteome, electrospray ionization-mass spectrometry of large, intact trans-membrane protein[J].Proc. Natl. Acad. Sci.. 1999.96:10695-10698
97. Woffenden B J, Freeman T B, Beer E P. Proteasome inhibitors prevent tracheary element differentiation in Zinnia mesophyll cell cultures. Plant Physiology, 1998, 118:419-430
98. Woodson W R.Handa A K. Changes in protein patterns and in vivo protein synthesis during presenescence and senescence of hibiscus petal. J. Plant Physiol.,1957b,128:67-75
99. Woodson W R. Changes in protein and mRNA population during the senescence of carnation petal. Physiol. Plant., 1987a,71:495-502
100. Woodson W R, Park K Y, Drory A, et al. Expression of ethylene biosynthesic pathway transcripts in senescing carnation flowers. Plant Physiol. 1992, 99:526-532
101. Wrigley C.W. Single-seed identification of wheat varieties: use of grain hardness testing. electrophoretic analysis and a rapid test paper for phenol reaction. Journal of the Science of food and agriculture, 1976,27(5):429-432
102. Wulster, G..Sacalis, J. and Janes, H.W..The effects of protein synthesis on ethylene-induced senescence in isolated carnation petal. J. Am. Soc. Hortic. Sci. ,1982.17:112-115
103. Wulster, G..Sacalis, J. and Janes, H. W.. Senescence in isolated carnation petal. Plant Physiol. ,1982.7.: 1039-1043.
104. Yao X. Khosravi-Far R. Chang H W. et al. Daxx : a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis.Cell, 1997,89:1067-1076
105. Yen C H, Yang C H. Evidence for programmed cell death during leaf senescence in plants. Plant cell Physiology, 1998,39(9):922-927