突变α-淀粉酶基因的高效表达及酶学性质研究
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摘要
本研究以野油菜黄单胞菌的野生α-淀粉酶基因和采用 5-溴脱氧尿苷三
磷酸（BrdUTP）在野生基因基础进行体外诱变后所得的酶活提高的基因为研
究对象,利用基因重组技术,成功构建了重组表达载体 pXC8004N 和 pXCH21N,
并在大肠杆菌中实现了高效表达,同时对重组菌破碎后所得的粗酶液的酶学
特性进行了分析研究。
1．利用原核表达载体 pET-30a(+)构建重组表达载体 pXC8004 和 pXCH21，
转化到宿主菌 BL21 中，利用 IPTG 诱导，使α-淀粉酶基因获得了高效表达。
通过对表达条件的摸索，当菌体 OD600为 0.4～0.6 时，IPTG 终浓度为 1mmol/L
时诱导结果最好，表达量约占菌体总蛋白的 11%，诱导表达温度以 26℃诱导
培养时可减少包涵体的形成。
2．重组菌株诱导表达后，调整二者的菌体 OD600相同,利用超声波破碎细
胞后，测定这两种粗酶液的酶活，比较二者之间的差别。在表达量相同的情
况下，诱变后的高酶活基因重组菌的酶活性比初始基因重组菌的酶活性高
30u/mL 。这说明突变位点处于酶活性部位，通过改变酶与底物的作用效果而
提高酶的活性。
3. 本试验设计的一对引物由于在起始密码子前多了一个碱基,致使构建
好的重组表达载体在翻译外源基因时发生了移码错误翻译,导致蛋白质的翻
译在 616 个碱基处遇到了 TAG 终止密码子,提前终止了翻译,产生了两个大小
为 24KDa 的错码蛋白质。测这两个蛋白的α－淀粉酶活性时发现其具有能够
水解淀粉的能力，也就是说这两个蛋白能够切开α-1、4 糖苷键，经测定这两
个蛋白的酶活性可达到 105U/mL。将这两个蛋白的氨基酸序列与野油菜黄单胞
菌的野生α－淀粉酶基因的氨基酸序列比对发现它们之间同源性只有 8％左
右。
Based on alpha-amylase gene and mutant gene of Xanthomonas campestris k8004,
pET-30a(+) plasmid ,The recombinant expression vector pXC8004 and pXCH21 was
constructed by gene cloning technology. The mutant gene was gotten for the original
alpha-amylase by gene-directde mutagenesis method. The activity of enzyme which was
expressed by the mutant gene was higher than the original gene. We have realized the two
recombinent vector pXC8004 and pXCH21 high level expression in E.coli BL21(DE3)PlusS.
1.The recombinant expression vector pXC8004 and pXCH21 wan transformated into E.coli
BL21 competent cell and induced by IPTG . We got the high-level expression of alpha-amylase
gene and its mutant. From the study of references and experiment, we got the optimum induced
conditions. When the OD600 of bacterial solution reached to 0.4~0.6 and the dose of IPTG
was 1mmol/l , the induced result was the best. The target proteins amount to 11% of the total
proteins in cell.
2.The induced cultivated E.coli BL21 was fragmentated by ultrasonic, then centrifugated and
kept in the supernatant. Analyzed the enzyme activity of supernatant in the same expression
amount , the result indicated that the enzyme activity of mutant gene recombinant expression
vector pXCH21 was higher than the original gene recombinant expression vector pXC8004 by
30U/L. So, we can conclude that it was the enzyme activity center that had been changed ,not the
increasing of enzyme expression amount which improved the activity of mutant alpha-amylase
gene.
3.We had designed a pair of pcr primers, but there was an extra base in its sense primer, which
resulted in terminating of translation of the target protein ahead of schedual. The molecular of
error-reading protein was 24 KDa. Although it had very low identity by comparing with the
original gene, the mutant gene had still the function of hydrolysis of α-1,4 glucosidican
linkages.
磷酸（BrdUTP）在野生基因基础进行体外诱变后所得的酶活提高的基因为研
究对象,利用基因重组技术,成功构建了重组表达载体 pXC8004N 和 pXCH21N,
并在大肠杆菌中实现了高效表达,同时对重组菌破碎后所得的粗酶液的酶学
特性进行了分析研究。
1．利用原核表达载体 pET-30a(+)构建重组表达载体 pXC8004 和 pXCH21，
转化到宿主菌 BL21 中，利用 IPTG 诱导，使α-淀粉酶基因获得了高效表达。
通过对表达条件的摸索，当菌体 OD600为 0.4～0.6 时，IPTG 终浓度为 1mmol/L
时诱导结果最好，表达量约占菌体总蛋白的 11%，诱导表达温度以 26℃诱导
培养时可减少包涵体的形成。
2．重组菌株诱导表达后，调整二者的菌体 OD600相同,利用超声波破碎细
胞后，测定这两种粗酶液的酶活，比较二者之间的差别。在表达量相同的情
况下，诱变后的高酶活基因重组菌的酶活性比初始基因重组菌的酶活性高
30u/mL 。这说明突变位点处于酶活性部位，通过改变酶与底物的作用效果而
提高酶的活性。
3. 本试验设计的一对引物由于在起始密码子前多了一个碱基,致使构建
好的重组表达载体在翻译外源基因时发生了移码错误翻译,导致蛋白质的翻
译在 616 个碱基处遇到了 TAG 终止密码子,提前终止了翻译,产生了两个大小
为 24KDa 的错码蛋白质。测这两个蛋白的α－淀粉酶活性时发现其具有能够
水解淀粉的能力，也就是说这两个蛋白能够切开α-1、4 糖苷键，经测定这两
个蛋白的酶活性可达到 105U/mL。将这两个蛋白的氨基酸序列与野油菜黄单胞
菌的野生α－淀粉酶基因的氨基酸序列比对发现它们之间同源性只有 8％左
右。
Based on alpha-amylase gene and mutant gene of Xanthomonas campestris k8004,
pET-30a(+) plasmid ,The recombinant expression vector pXC8004 and pXCH21 was
constructed by gene cloning technology. The mutant gene was gotten for the original
alpha-amylase by gene-directde mutagenesis method. The activity of enzyme which was
expressed by the mutant gene was higher than the original gene. We have realized the two
recombinent vector pXC8004 and pXCH21 high level expression in E.coli BL21(DE3)PlusS.
1.The recombinant expression vector pXC8004 and pXCH21 wan transformated into E.coli
BL21 competent cell and induced by IPTG . We got the high-level expression of alpha-amylase
gene and its mutant. From the study of references and experiment, we got the optimum induced
conditions. When the OD600 of bacterial solution reached to 0.4~0.6 and the dose of IPTG
was 1mmol/l , the induced result was the best. The target proteins amount to 11% of the total
proteins in cell.
2.The induced cultivated E.coli BL21 was fragmentated by ultrasonic, then centrifugated and
kept in the supernatant. Analyzed the enzyme activity of supernatant in the same expression
amount , the result indicated that the enzyme activity of mutant gene recombinant expression
vector pXCH21 was higher than the original gene recombinant expression vector pXC8004 by
30U/L. So, we can conclude that it was the enzyme activity center that had been changed ,not the
increasing of enzyme expression amount which improved the activity of mutant alpha-amylase
gene.
3.We had designed a pair of pcr primers, but there was an extra base in its sense primer, which
resulted in terminating of translation of the target protein ahead of schedual. The molecular of
error-reading protein was 24 KDa. Although it had very low identity by comparing with the
original gene, the mutant gene had still the function of hydrolysis of α-1,4 glucosidican
linkages.
引文
1.张树政等：酶制剂工业. 科学出版社. 北京 1984
2.The Amylase Research Society Japan(Ed): Handbook of Amylase and Related
Enzymes,Oxford ,PergamonPress, 1988, p. 53－56.
3.郭勇主编. 酶工程. 中国轻工业出版社. 北京 1994
4.谷军 α-淀粉酶的生产与应用. 生物技术 1994,4(3):1－5
5.Amylase hyperproduction by deregulated mutants of the thermophilic fungus
Thermomyces lanuginosus K Rubinder1, BS Chadha1, N Singh2, HS Saini1 and S Singh1
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 29, 70 –74
6.王桂芬 蒋如璋 吴立云等，枯草芽孢杆菌 BF－7658 α一淀粉酶的性质.微生物学报，
1989，29（2）：124～128
7.孔显良 王俊英 崔雅洁等. 米曲霉 6－193α一淀粉酶的纯化和性质研究.微生物学报，
1991，31（4）：274－280.
8.赵荧 刘宝琦 王国彦 董庆初 马鹤文 闰宝山 地衣芽袍杆菌高温α一淀粉酶的组成
及光谱学性质 微生物学通报 1998年 25 （4）
9.赵荧 董庆初 马鹤文 阎宝山 费小芳 王国彦 地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α一淀粉酶
热稳定性及构象研究 高等学校化学学报 1998年6月 Vol.19 No.6 921～923
10.刘莉 陈炜 金城 芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶的基因在大肠杆菌中的克隆和表达
微生物学报, 2000,40(3),323-326
11.H. Outtrup, K. Aunstrup: Proceedings of the First Intersectional Congress of
IAMS, ,Science Council of Japan 1975,5,204-209
12.邬显章：生物工程学报，1988,4（2），119-126
13.Fujita, M.etal: J.Bacteriol, 1989,171:1333-1339
14.R. NaKAJIMA, T. IMANKA, S. AIBA: comparision of amino acid sequences of eleven
different α- amylases. Applied and Microbiological Biotechnology, 1986, 23,
355-360
４５
15. Y.MATSUURA, M. KUSUNOKI, W. Hayada et al : Structure and possible catalytic
residues of TAKA-amylase. Journal of Biochemistry, 1984,95, 697-702
16.张亚川 马文 冯一兵 α一淀粉酶研究的最新状况 肉品卫生，1999 NO.8
17.任随周：河南农业大学硕士论文 2001
18.Gaboriaud , C, etal.: TEBS, 1997,224:149-155
19.邹俊 马建华 毕汝昌 淀粉酶的同源性研究 生物物理学报 vol.13, No,4 Dec
1997
20.Fujita M,Torigoe K, Nakada T, et al. Cloning and nucleotide sequence of the
gene(amyp) for maltoteraose amylase from Pseudomomas stutzeri MO-19. Bacteriol,
1989, 171（3）：1333－1339.
21. Taka S, IMURA Y ,Gomi k, et al. Cloning and nucleotide sequence of the genomic
taka-amylasrs a gene of Aspergillus oryzae.Agric Biol Chem,1989,53(3)593-599
22.Kuriki T.Okada s,Imanaka T. New type of pullulanase from Bacillus stearo
thermophilius and molecular cloning and expression of the gene in Bacillus su
btillis.
23.Hu N T, Hung M N, Huang A M, et al: Molecular cloning , characterizatiom
and nucleotide sequence of the gene for secreted α一 amylase from Xanthomo
nas campestris pv.Campestris. Journal of General Microbiology , 1992,138(8):
1647-1655.
24.王正祥 刘吉泉 诸葛健 微生物酶的分子改性和人工进化的研究进展 生物工程学
报， Vol 16 No.3 May 2000
25.吴晓萍 李文清 罗进贤等 α一淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建 中
山大学学报（自然科学版），Vol 38 No 2 Mar 1999
26.任立明，陈永福：用随机整和法在芽包杆菌 中表达高温α-淀粉酶基因。 农业生物技
术学报，1994，2（1），50-56
27.yuki:Biochem.Biophys.Res.Comm., 1968,31,182,
４６
28.Lin Long Liu,Ma Yih-Jer,Chien Hungchien Roger et al:Construction of an
amylolytic yeast by multiple integration of the Aspergillus awamoris glucoamylase
gene into a Saccharomyces cerevisiae chromosome ,Enzyme and Microbial Tech. 1998,
23(6), 360-365
29.S.A. orilepp: Molecular cloning in Bacillus subtilis Ph.D. Thesis. Trinity
College Dublin Ireland 1983
30.D.M. Rothstein ,P.E. Devlin, R.L. Cate: Journal Bacteriol 1986,168,839-842
31.Sen S. Oriel P.: Biotechnology Letters 1989,11(11),789-792
32.Ji-Hu Zhang, GLENN DAWES,WILLEM P.C.SSTEMMER:Directeed evolution of a
fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc. Natl. Acad.
Sci USA 1997,94,4504-4509
33.Willem P.C. Stemmer:Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.
Letters To Nature 1994,370(4),389-391
34.马向东：华中农业大学博士论文，2000
35.沈 微 华国强 王正样 唐雪明 诸葛健 古菌 Pyrococcus furiosus 嗜热α—淀粉酶
基因在酿酒酵母中的表达 微生物学通报，2003， 30（3）
36.温进坤 韩梅主编 医学分子生物学原理与研究技术（第二版）,科学出版社,北京,2002
37.Struhl K,Cameron J R,Davis R W.1976. Functional genetic expression of euk
aryotic DNA in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.73:1471-1475
38.Vapnek D,Hautala J A, Jacobson J W et al.1977.Expression in Escherichia co
li K-12 of the structural gene for catabolic dehudroquinase of Neurospoa cras
sa.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74(8):3508-3512
39.Chang A C Y,Nunberg J N,Kaufman R J et al.1978.Phenotypic expression in E.
coli of a DNA sequence coding for mouse dihydrofolate reductase .Nature,275:6
17-624
40.靳卫东 宋增璇 质粒克隆载体研究进展 生命的化学，1997 年 17 卷 6 期
４７
41.李育阳主编 基因表达技术 2000 北京 科学技术出版社.
42.杨云贵 大肠杆菌表达系统研究进展 博士学位论文综述部分
43.YANG Shan ZHAO jing-hui HUA Zi-chun pNJUTRX-1,A THIOREDOXIN BICISTRON EXP
RESSION VECTOR FOR ENHANCE EMENT OF SOLUBILITY OF RECOMBINANT PROTEINS EXPRES
SED IN Escherichia coli Journal of nanjing university(Natural Science) Vol.
36,No.4 July,2000
44.王磊 周新宇 唐上华 任大明.1998 碱性蛋白酶基因在 Bacillus licheniformis 2709
的整合和一般性质.微生物学通报，24：195－198
46.许赣荣，高木昌宏 森川正章 今中忠行.1991.碱性高温淀粉酶基因的克隆与表达及酶
特性的初步研究. 无锡轻工业学院院报，10：36－42
47.郑敏 张飞雄 刘丽 酵母表达系统表达外源基因的研究进展. 首都师范大学学报（自
然科学版）Vol.20,No.4 Dec 1999
48.Hitzeman RA ,Hagie FE Levine HL et al.1981.Expression of human gene for in
terferon in yeast .Nature,293:717-722
47.张绪峰 焦炳华 成国祥 酵母人工染色体转基因研究及其应用.生命的化学.2003 年 23
卷 3 期.
49.宋丽雅 于群 卜凤荣 几种主要的酵母表达系统研究进展. 中国输血杂志，2003 年 6
月第 16 卷第 3 期
50．韦宇拓 赵颖怡 黄日波 甲醇酵母表达系统研究进展.生物技术 Vol.12 No.4:42 Aug.
2002
51.熊宗贵主编 生物技术制药 1999 北京 高等教育出版社
52.李宏 杨体强 达赖 罗辽复 大肠杆菌 SD 序列与基因表达水平的关系 内蒙古大学学报
（自然科学版） Vol.29 No.2 Mar.1998
53.杨吉吉 李太华 徐维明 大肠杆菌中外源基因表达的研究进展 微生物学免疫学研究
进展 2002 年第 28 卷第 2 期
54.童克中著 基因及其表达 2001 北京 科学技术出版社
４８
55.张毅 曲贤铭 杨胜利 融合蛋白基因工程应用及研究 生物工程进展 Vol20.No.3 200
0
56.李伍举 吴家金 pBV220 载体中外源基因表达水平的定量分析. 1997 病毒学报，
13：126－132
57.吴家金 李伍举 雷红星 核酸与蛋白序列分析的软件系统－GOLDKEY.1994 生物技术通
讯，5：189－192
58．Sam brool J, Fritsch Z F,Maniatis T.: Molecular cloning : a laboratory manual,
2nd ed, New York. Cold spring harbor laboratory press, 1989
59.Hirosli Inoue, Hiroshi Nojima, Hiroto Okayama: High efficiency transformation
of Escherichia coli with plasmids. Gene, 1990,96,23-28
60.王家政 范明主编 蛋白质技术手册. 2000 科学技术出版社
61.魏群主编 生物工程技术实验指导. 2002 高等教育出版社
62.卢圣栋主编 现代分子生物学实验技术 高等教育出版社，北京，1995
63.刘振盈 张华 一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体的方法。1998,2（4）：359－361
64.肖庚富 齐义鹏 李莉 易魏 一种快速简便的 CaCl2质粒转化法。 生物化学与生物物理
进展，2000，27（1）：96－98.
65.万波 郑莉 程书秋.大肠杆菌感受态细胞培养与冻存条件的研究. 微生物学通报，1997，
24（4）：234－236.
66.李路怡 易建华 李敏. 大肠杆菌感受态细胞制备的探讨. 生命科学研究， 1998 2（3）：
194－198
67.迪芬巴赫（美） 德维克思勒（美） 黄培堂等译. PCR 技术实验指南.科学出版社，北
京，1998
68.吴乃虎著 基因工程原理. 科学出版社，北京，1998
69.McPherson M J,et al. PCR: a practical approach, Oxford: Oxford Univ.Pr.,1991.
70.刘莉 吴襟 陈炜 张树政 芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶的基因工程菌表达条件的优化.
中国生物工程杂志 2003 年 1 月第 23 卷第 1 期
４９
71.侯松旺 李小洁 马辉文 受乳糖启动子控制的基因表达过程的优化 武汉大学学报
（自然科学版）Vol.44 No.4 1998,513～516
72.郭尧君编著 蛋白质电泳实验技术 1999 北京 科学出版社
73.Yong J.Yoo Juan Hong Radnolph T. Hatch Comparison of α-Amylase Activities
from Different Assay Methods Biotechnology and Bioengineering Pp:147-151,1978
74.史昶 姜涌明 五种α-淀粉酶测活方法的比较研究 微生物学通报 1996 23(6)
2.The Amylase Research Society Japan(Ed): Handbook of Amylase and Related
Enzymes,Oxford ,PergamonPress, 1988, p. 53－56.
3.郭勇主编. 酶工程. 中国轻工业出版社. 北京 1994
4.谷军 α-淀粉酶的生产与应用. 生物技术 1994,4(3):1－5
5.Amylase hyperproduction by deregulated mutants of the thermophilic fungus
Thermomyces lanuginosus K Rubinder1, BS Chadha1, N Singh2, HS Saini1 and S Singh1
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 29, 70 –74
6.王桂芬 蒋如璋 吴立云等，枯草芽孢杆菌 BF－7658 α一淀粉酶的性质.微生物学报，
1989，29（2）：124～128
7.孔显良 王俊英 崔雅洁等. 米曲霉 6－193α一淀粉酶的纯化和性质研究.微生物学报，
1991，31（4）：274－280.
8.赵荧 刘宝琦 王国彦 董庆初 马鹤文 闰宝山 地衣芽袍杆菌高温α一淀粉酶的组成
及光谱学性质 微生物学通报 1998年 25 （4）
9.赵荧 董庆初 马鹤文 阎宝山 费小芳 王国彦 地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α一淀粉酶
热稳定性及构象研究 高等学校化学学报 1998年6月 Vol.19 No.6 921～923
10.刘莉 陈炜 金城 芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶的基因在大肠杆菌中的克隆和表达
微生物学报, 2000,40(3),323-326
11.H. Outtrup, K. Aunstrup: Proceedings of the First Intersectional Congress of
IAMS, ,Science Council of Japan 1975,5,204-209
12.邬显章：生物工程学报，1988,4（2），119-126
13.Fujita, M.etal: J.Bacteriol, 1989,171:1333-1339
14.R. NaKAJIMA, T. IMANKA, S. AIBA: comparision of amino acid sequences of eleven
different α- amylases. Applied and Microbiological Biotechnology, 1986, 23,
355-360
４５
15. Y.MATSUURA, M. KUSUNOKI, W. Hayada et al : Structure and possible catalytic
residues of TAKA-amylase. Journal of Biochemistry, 1984,95, 697-702
16.张亚川 马文 冯一兵 α一淀粉酶研究的最新状况 肉品卫生，1999 NO.8
17.任随周：河南农业大学硕士论文 2001
18.Gaboriaud , C, etal.: TEBS, 1997,224:149-155
19.邹俊 马建华 毕汝昌 淀粉酶的同源性研究 生物物理学报 vol.13, No,4 Dec
1997
20.Fujita M,Torigoe K, Nakada T, et al. Cloning and nucleotide sequence of the
gene(amyp) for maltoteraose amylase from Pseudomomas stutzeri MO-19. Bacteriol,
1989, 171（3）：1333－1339.
21. Taka S, IMURA Y ,Gomi k, et al. Cloning and nucleotide sequence of the genomic
taka-amylasrs a gene of Aspergillus oryzae.Agric Biol Chem,1989,53(3)593-599
22.Kuriki T.Okada s,Imanaka T. New type of pullulanase from Bacillus stearo
thermophilius and molecular cloning and expression of the gene in Bacillus su
btillis.
23.Hu N T, Hung M N, Huang A M, et al: Molecular cloning , characterizatiom
and nucleotide sequence of the gene for secreted α一 amylase from Xanthomo
nas campestris pv.Campestris. Journal of General Microbiology , 1992,138(8):
1647-1655.
24.王正祥 刘吉泉 诸葛健 微生物酶的分子改性和人工进化的研究进展 生物工程学
报， Vol 16 No.3 May 2000
25.吴晓萍 李文清 罗进贤等 α一淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建 中
山大学学报（自然科学版），Vol 38 No 2 Mar 1999
26.任立明，陈永福：用随机整和法在芽包杆菌 中表达高温α-淀粉酶基因。 农业生物技
术学报，1994，2（1），50-56
27.yuki:Biochem.Biophys.Res.Comm., 1968,31,182,
４６
28.Lin Long Liu,Ma Yih-Jer,Chien Hungchien Roger et al:Construction of an
amylolytic yeast by multiple integration of the Aspergillus awamoris glucoamylase
gene into a Saccharomyces cerevisiae chromosome ,Enzyme and Microbial Tech. 1998,
23(6), 360-365
29.S.A. orilepp: Molecular cloning in Bacillus subtilis Ph.D. Thesis. Trinity
College Dublin Ireland 1983
30.D.M. Rothstein ,P.E. Devlin, R.L. Cate: Journal Bacteriol 1986,168,839-842
31.Sen S. Oriel P.: Biotechnology Letters 1989,11(11),789-792
32.Ji-Hu Zhang, GLENN DAWES,WILLEM P.C.SSTEMMER:Directeed evolution of a
fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc. Natl. Acad.
Sci USA 1997,94,4504-4509
33.Willem P.C. Stemmer:Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.
Letters To Nature 1994,370(4),389-391
34.马向东：华中农业大学博士论文，2000
35.沈 微 华国强 王正样 唐雪明 诸葛健 古菌 Pyrococcus furiosus 嗜热α—淀粉酶
基因在酿酒酵母中的表达 微生物学通报，2003， 30（3）
36.温进坤 韩梅主编 医学分子生物学原理与研究技术（第二版）,科学出版社,北京,2002
37.Struhl K,Cameron J R,Davis R W.1976. Functional genetic expression of euk
aryotic DNA in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.73:1471-1475
38.Vapnek D,Hautala J A, Jacobson J W et al.1977.Expression in Escherichia co
li K-12 of the structural gene for catabolic dehudroquinase of Neurospoa cras
sa.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74(8):3508-3512
39.Chang A C Y,Nunberg J N,Kaufman R J et al.1978.Phenotypic expression in E.
coli of a DNA sequence coding for mouse dihydrofolate reductase .Nature,275:6
17-624
40.靳卫东 宋增璇 质粒克隆载体研究进展 生命的化学，1997 年 17 卷 6 期
４７
41.李育阳主编 基因表达技术 2000 北京 科学技术出版社.
42.杨云贵 大肠杆菌表达系统研究进展 博士学位论文综述部分
43.YANG Shan ZHAO jing-hui HUA Zi-chun pNJUTRX-1,A THIOREDOXIN BICISTRON EXP
RESSION VECTOR FOR ENHANCE EMENT OF SOLUBILITY OF RECOMBINANT PROTEINS EXPRES
SED IN Escherichia coli Journal of nanjing university(Natural Science) Vol.
36,No.4 July,2000
44.王磊 周新宇 唐上华 任大明.1998 碱性蛋白酶基因在 Bacillus licheniformis 2709
的整合和一般性质.微生物学通报，24：195－198
46.许赣荣，高木昌宏 森川正章 今中忠行.1991.碱性高温淀粉酶基因的克隆与表达及酶
特性的初步研究. 无锡轻工业学院院报，10：36－42
47.郑敏 张飞雄 刘丽 酵母表达系统表达外源基因的研究进展. 首都师范大学学报（自
然科学版）Vol.20,No.4 Dec 1999
48.Hitzeman RA ,Hagie FE Levine HL et al.1981.Expression of human gene for in
terferon in yeast .Nature,293:717-722
47.张绪峰 焦炳华 成国祥 酵母人工染色体转基因研究及其应用.生命的化学.2003 年 23
卷 3 期.
49.宋丽雅 于群 卜凤荣 几种主要的酵母表达系统研究进展. 中国输血杂志，2003 年 6
月第 16 卷第 3 期
50．韦宇拓 赵颖怡 黄日波 甲醇酵母表达系统研究进展.生物技术 Vol.12 No.4:42 Aug.
2002
51.熊宗贵主编 生物技术制药 1999 北京 高等教育出版社
52.李宏 杨体强 达赖 罗辽复 大肠杆菌 SD 序列与基因表达水平的关系 内蒙古大学学报
（自然科学版） Vol.29 No.2 Mar.1998
53.杨吉吉 李太华 徐维明 大肠杆菌中外源基因表达的研究进展 微生物学免疫学研究
进展 2002 年第 28 卷第 2 期
54.童克中著 基因及其表达 2001 北京 科学技术出版社
４８
55.张毅 曲贤铭 杨胜利 融合蛋白基因工程应用及研究 生物工程进展 Vol20.No.3 200
0
56.李伍举 吴家金 pBV220 载体中外源基因表达水平的定量分析. 1997 病毒学报，
13：126－132
57.吴家金 李伍举 雷红星 核酸与蛋白序列分析的软件系统－GOLDKEY.1994 生物技术通
讯，5：189－192
58．Sam brool J, Fritsch Z F,Maniatis T.: Molecular cloning : a laboratory manual,
2nd ed, New York. Cold spring harbor laboratory press, 1989
59.Hirosli Inoue, Hiroshi Nojima, Hiroto Okayama: High efficiency transformation
of Escherichia coli with plasmids. Gene, 1990,96,23-28
60.王家政 范明主编 蛋白质技术手册. 2000 科学技术出版社
61.魏群主编 生物工程技术实验指导. 2002 高等教育出版社
62.卢圣栋主编 现代分子生物学实验技术 高等教育出版社，北京，1995
63.刘振盈 张华 一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体的方法。1998,2（4）：359－361
64.肖庚富 齐义鹏 李莉 易魏 一种快速简便的 CaCl2质粒转化法。 生物化学与生物物理
进展，2000，27（1）：96－98.
65.万波 郑莉 程书秋.大肠杆菌感受态细胞培养与冻存条件的研究. 微生物学通报，1997，
24（4）：234－236.
66.李路怡 易建华 李敏. 大肠杆菌感受态细胞制备的探讨. 生命科学研究， 1998 2（3）：
194－198
67.迪芬巴赫（美） 德维克思勒（美） 黄培堂等译. PCR 技术实验指南.科学出版社，北
京，1998
68.吴乃虎著 基因工程原理. 科学出版社，北京，1998
69.McPherson M J,et al. PCR: a practical approach, Oxford: Oxford Univ.Pr.,1991.
70.刘莉 吴襟 陈炜 张树政 芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶的基因工程菌表达条件的优化.
中国生物工程杂志 2003 年 1 月第 23 卷第 1 期
４９
71.侯松旺 李小洁 马辉文 受乳糖启动子控制的基因表达过程的优化 武汉大学学报
（自然科学版）Vol.44 No.4 1998,513～516
72.郭尧君编著 蛋白质电泳实验技术 1999 北京 科学出版社
73.Yong J.Yoo Juan Hong Radnolph T. Hatch Comparison of α-Amylase Activities
from Different Assay Methods Biotechnology and Bioengineering Pp:147-151,1978
74.史昶 姜涌明 五种α-淀粉酶测活方法的比较研究 微生物学通报 1996 23(6)