单抗竞争ELISA快速检测肠炎沙门氏菌方法的建立
摘要
本研究从已建立的抗沙门氏菌单抗中筛选出适用于肠炎沙门氏菌
ELISA快速检验的3—47—26单抗，采用筛选强阳性杂交瘤细胞株制备
了高效价的3—47—26单抗。改进了用辣根过氧化物酶标记高效价单抗
的方法，进行了HRP标记单抗的免疫生物学特性的鉴定。提取制备了肠
炎沙门氏菌脂多糖，并对蛋白质和糖的含量进行了测定，提取液中蛋白
质含量为0.17mg/ml，多糖含量为136.6ug/ml。确定了包被浓度和酶标抗
体的工作浓度：HRP—3—47—26为1∶100；LPS的包被浓度为400ng/ml。
试验中采用LPS与多聚赖氨酸的结合，解决了包被过程中的解吸附
作用，增强了包被的稳定性，同时也减少了假阳性反应，优化了包被过
程。建立了检测肠炎沙门氏菌的抗原竞争ELISA方法，利用样品中的
LPS抑制酶标抗体与包被的LPS结合，以降低底物反应的颜色从而达到
检测的目的。通过对210份肠炎沙门氏菌感染鸡泄殖腔棉拭子、羽毛和
组织样品先筛选后鉴定的方法进行检测具有明显的抑制作用，通过与国
标法对大量的样品检测结果比较表明，竞争ELISA方法的检出率为18.09％；
检出阳性样品36份，国标法检出率为17.14％；两者符合率为97.14％。竞
争ELISA敏感性和特异性分别为94.4％和97.7％。从而为肠炎沙门氏菌
的检测提供了一种敏感、特异、快速的检测方法。
通过以上研究工作，初步确定了肠炎沙门氏菌的ELISA检测程序，
其方法的试验条件还有待进一步完善和标准化，以便为试剂盒的研制打
下基础。
Establishment of A Monoclonal Antibody ased
CLISA to Detect S. enteritidis
Abstract:In this present study, a monoclonal antibody(McAb) 347-26 specific
to 09,was used to establish competitive Enzyme-linked immunosorbed
assays(C-ELISA) of detection for Salmonella enteritidis.
A hybridomas cell strain 3-47-26 was screened and preparated the high
valence monoclonal antibody. The linking method of McAb with HRP was
improved and the specificity of HRP-3-47-26 was accredited. During the the
experiment, Samonella enteritidis Lipopolysaccharidel(LPS) was preparated
and was determined the ingredient pertain, 0.1 7mg/ml;Polysaccharide,
136.6ug/ml. The concentration of coating of antigen LPS and HRP-3-47-26
was determined HRP-3-47-26, 1:1 00;LPS,400ng/ml. Stable coating and
minimal false positives were achieved by conjugating LPSto poly-L-lysine,
which solved the desorption problem. S.enteritidis LPS in samples competed
with S.enteritidis LPS coated on microtitre plate, and competition first
reduced binding of McAb to the S.enteritidis LPS on the plate hence to
reduce the chromogenic signal, which the aim of detection for sample. The
C-ELISA was very specific and no cross reaction, and it was observed in
detection sera induced by related Sammonella A-F, Compared with routine
detective method for the detection of S.enteritidis, and the sensitivity and
specificity of the C-ELISA were 98.7% and 99.3% respectively.
A C-ELISA developed was attempted to provide a raped, sensitive and
specific test for detecting S.enteritidis. As above study, The program of
surveillance and standardized in order to make pave for ELISA kit for the
detection of S.enteritidis from different specimens in this study.
ELISA快速检验的3—47—26单抗，采用筛选强阳性杂交瘤细胞株制备
了高效价的3—47—26单抗。改进了用辣根过氧化物酶标记高效价单抗
的方法，进行了HRP标记单抗的免疫生物学特性的鉴定。提取制备了肠
炎沙门氏菌脂多糖，并对蛋白质和糖的含量进行了测定，提取液中蛋白
质含量为0.17mg/ml，多糖含量为136.6ug/ml。确定了包被浓度和酶标抗
体的工作浓度：HRP—3—47—26为1∶100；LPS的包被浓度为400ng/ml。
试验中采用LPS与多聚赖氨酸的结合，解决了包被过程中的解吸附
作用，增强了包被的稳定性，同时也减少了假阳性反应，优化了包被过
程。建立了检测肠炎沙门氏菌的抗原竞争ELISA方法，利用样品中的
LPS抑制酶标抗体与包被的LPS结合，以降低底物反应的颜色从而达到
检测的目的。通过对210份肠炎沙门氏菌感染鸡泄殖腔棉拭子、羽毛和
组织样品先筛选后鉴定的方法进行检测具有明显的抑制作用，通过与国
标法对大量的样品检测结果比较表明，竞争ELISA方法的检出率为18.09％；
检出阳性样品36份，国标法检出率为17.14％；两者符合率为97.14％。竞
争ELISA敏感性和特异性分别为94.4％和97.7％。从而为肠炎沙门氏菌
的检测提供了一种敏感、特异、快速的检测方法。
通过以上研究工作，初步确定了肠炎沙门氏菌的ELISA检测程序，
其方法的试验条件还有待进一步完善和标准化，以便为试剂盒的研制打
下基础。
Establishment of A Monoclonal Antibody ased
CLISA to Detect S. enteritidis
Abstract:In this present study, a monoclonal antibody(McAb) 347-26 specific
to 09,was used to establish competitive Enzyme-linked immunosorbed
assays(C-ELISA) of detection for Salmonella enteritidis.
A hybridomas cell strain 3-47-26 was screened and preparated the high
valence monoclonal antibody. The linking method of McAb with HRP was
improved and the specificity of HRP-3-47-26 was accredited. During the the
experiment, Samonella enteritidis Lipopolysaccharidel(LPS) was preparated
and was determined the ingredient pertain, 0.1 7mg/ml;Polysaccharide,
136.6ug/ml. The concentration of coating of antigen LPS and HRP-3-47-26
was determined HRP-3-47-26, 1:1 00;LPS,400ng/ml. Stable coating and
minimal false positives were achieved by conjugating LPSto poly-L-lysine,
which solved the desorption problem. S.enteritidis LPS in samples competed
with S.enteritidis LPS coated on microtitre plate, and competition first
reduced binding of McAb to the S.enteritidis LPS on the plate hence to
reduce the chromogenic signal, which the aim of detection for sample. The
C-ELISA was very specific and no cross reaction, and it was observed in
detection sera induced by related Sammonella A-F, Compared with routine
detective method for the detection of S.enteritidis, and the sensitivity and
specificity of the C-ELISA were 98.7% and 99.3% respectively.
A C-ELISA developed was attempted to provide a raped, sensitive and
specific test for detecting S.enteritidis. As above study, The program of
surveillance and standardized in order to make pave for ELISA kit for the
detection of S.enteritidis from different specimens in this study.
引文
[1]何晓青．卫生防疫细菌检验．南昌新华出版社．1989．301—317．
[2]孙锡斌．动物性食品卫生检验．武汉，湖北科技出版社．1985：7．
[3]Meyer. H, Animal as sources of infections in humans-salmonellosis, Poultry Abstracts.1999.25(12)52-53.
[4]张书存等，国外鼠伤寒沙门氏菌的研究概况，肉品卫生，2000，198(12)：36．
[5]王章云等，肠炎沙门氏菌引起的食物中毒细菌学调查，中国人兽共患病杂志，1999，15(3)：115．
[6]韩志辉，动物性饲料中沙门氏菌的分离鉴定，中国预防兽医学报，2000，22(4)：308—309．
[7]王敬先，沙门氏菌感染引起产蛋鸡肝脏破裂，中国家禽，1999，21(7)：23．
[8]杜秀珍 雏鸡和鸡蛋肠炎沙门氏菌的检测与控制研究进展，中兽医医药杂志1997，5：17-18。
[9]胡捷，防止皮蛋沙门氏菌食物中毒的快速检验研究，肉品卫生，1997，7(7)：1-4
[11]蔡学忠等，沙门氏菌鞭毛相变的分子遗传学机制研究进展遗传，1995：70-80。
[12]Saeed. A. M.The impact of Salmonella enteritidis on public health and environmental quality, United States Animal Health Association 1998: 541-554.
[13]杜元钊，沙门氏菌的研究情况报告 内部资料
[14]张碧波等，应用噬菌体快速检测沙门氏菌 动物检疫，1994，11：1-2．
[15]Cloak. O.M, et al, Development of a surface adhesion immunofluorescent technique for the rapid detection of Salmonella. spp. from meat and poultry. Journal of Applied Micrpbiology. 1999.4. 583-590.
[16]Ploner M. Development of piezoelectric immunosensor for detection of entrrobacteria Enzymol Micro Technol, 1992, 14(3):2340
[17] Fitts R. DNA-DN hybridization assay for detection of Salmonella spp. in foods, Appli Microbiol 1983,46:1146-1151.
[18] Prusak-Sochaczewski E, luong JHT and Guilault GG, Development of a piezoelectric immunosersor for the detection of Salmonella typhimurium, Enzymol Micro Technol, 1990. 12:173.
[19] Soumet C, et al. Identification by a multiplex PCR-based assay of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis strains from enviromental swabs of poultry houses. Letters in Applied Miorobiology (1999) 29 (1) 1-6.
[20] 文其乙：沙门氏菌的基因分型和指纹图谱分析及其在分子流行病学中的应用中国畜禽传染病，1994．6：57—59．
[21] 苏世彦．食品微物物检验手册．中国轻工业出版社．1998：20
[22] Krysinki E.P. et al. Use of enzyme-labelled antibodies to detect Salmonella in food. Appl. Envoiron. Microbiol. 1977.33.947.
[23] Swaminathan B. Enzyme immunoassays for salmonella: Onesday testing is now a reality. Food. Tech. 1980.39.93-89.
[24] Robinson, BJ. Enzyme immuno, assay in which a myeloma protein is used for detection of salmonella. Appli Envion Microbiol. 1983.45. 1816-1821.
[25] Anderson JM, Direct immunoassay for detection of Samonella in foods and feeds. Appli Enviroml Microbio 1985:49.1124-1127.
[26] Mattingly J.A. An enzyme immunoassay for the detection of all Salmonella using a combination of a myeloma protein and a hybridoma antibody. J. of Immunol. Methods. 1984,73:147-156.
[27] 马彬等，用ELISA双抗体夹心快速检验肉品污染的沙门氏菌 中国兽医科技，1992，22(5)：21-23。
[28] 周宗清，抗沙门氏菌单抗夹心ELISA试验的建立与应用于 上海农业学报刊1992，8，57-64
[29]王志亮等，沙门氏菌属特异性单克隆抗体检测试剂的研制及初步鉴定，江苏农学院学报，1993，14(2)69-73
[30]文其乙，应用直接ELISA检测肉品中的沙门氏菌，肉品卫生，1994，9：1-3．
[31]文其乙 应用直接ELISA检测蛋品中的沙门氏菌 中国卫生检验杂志 1996，6：358-359．
[32]文其乙 应用直接ELISA检测鲜奶中的沙门氏菌 中国人兽共患病杂志1995，11(6)：41—42．
[33]顾炳泉，用单抗ELISA快速检验鱼粉沙门氏菌 中国兽医杂志 2000，26(6)：54
[34]郑明光，动物性食品卫生学 吉林科学技出版社 1999，17—22。
[35]陈士恩等，细菌内毒素(脂多糖)化学结构研究的某些进展 动物毒物学1989，4(1)：35—5．
[36]钟启平等，酶解凝胶色谱法制备志贺氏菌脂多糖，微生物学通报，1997，24(5)：313-314．
[37]焦新安等，沙门氏菌单克隆抗体应用研究的进展 单克隆抗体通讯1990 b(4)：62-66．
[38]张如宽等，抗沙门氏菌O_4、O_(12)抗原特异单克隆抗体的产生及其特性鉴定江苏农学院学报，1988，9(1)：1—4．
[39]杜元钊等，抗沙门氏菌H_s、Hb、Hd单抗的研制 江苏农学院学报 1989，10(3)：26．
[40]蔡玲民等，沙门氏菌单克隆抗体研究 杂交瘤细胞系的建立2单克隆抗体通迅1990，6(2)：22-30．
[41]S. Tan, et. al Comparison of an LPS-specific competitive ELISA with a motility enrichment cuiture method(MSRV) for detection of Salmonella typhimurium and S. enteritidis in chickens, Veterinary Microbiology 1997(56): 79-86
[42]张艳红等，沙门氏菌快速检测方法研究进展 动物医学进展 2001：2．39-41
[43]Zamora, B.M Detection of antibodies to S. [Salmonella]enteritidis in broilers by means of indirect ELISA and Chemical luminescent immunology assay (CLIA).Journal Veterinary. Medical Series B, 1999. 46(1):229--238.
immunology assay (CLIA).Journal Veterinary. Medical Series B, 1999. 46(1):229--238.
[44]ouglas, D.C. et al , Infect. Immunol 1982, 36 (2): 764-763.
[45]焦新安等，沙门氏菌单克隆抗体检测试剂的研制与应用 中国兽医科技工 1991，21(12)：48-50．
[46]张艳红等，肠炎沙门氏菌脂多糖的提取与制备 动物医学进展 200：3．
[47]李肇增等，鸡白痢菌脂多糖的提取与制备 内蒙古畜牧科学，1997，2：36-38．
[48]黄伟坤主编 食品检验与分析 北京 中国轻工业出版社 1995：32．
[49]Pak-Leong Lim et. al, Diagnosis of enteric fever by inhibition assay using peroxides-labeled monoclonal antibody and salmonella typhi lipoplysaccharide. Aust. J. EXP. Med Sci; 61(6):687--704.
[50]文其乙 沙门氏菌快速检测试剂盒的研制及对样品中的沙门氏菌污染的监测 硕士论文 1995．
[51]陈宝钦 进口动物产品沙门氏菌检验报告 中国进出境动植检1994，3：27-29
[52]J.V. Hassan. etal. Antibody response to experimented Salmonella typhimuriu infection in chickens measured by ELASA. The Veterinary Record, May 26, 1990 519-522.
[53]焦新安等，应用单克隆抗体检测伤寒抗体的研究 中华医学检验杂志1990，13(6)：344-348．
[2]孙锡斌．动物性食品卫生检验．武汉，湖北科技出版社．1985：7．
[3]Meyer. H, Animal as sources of infections in humans-salmonellosis, Poultry Abstracts.1999.25(12)52-53.
[4]张书存等，国外鼠伤寒沙门氏菌的研究概况，肉品卫生，2000，198(12)：36．
[5]王章云等，肠炎沙门氏菌引起的食物中毒细菌学调查，中国人兽共患病杂志，1999，15(3)：115．
[6]韩志辉，动物性饲料中沙门氏菌的分离鉴定，中国预防兽医学报，2000，22(4)：308—309．
[7]王敬先，沙门氏菌感染引起产蛋鸡肝脏破裂，中国家禽，1999，21(7)：23．
[8]杜秀珍 雏鸡和鸡蛋肠炎沙门氏菌的检测与控制研究进展，中兽医医药杂志1997，5：17-18。
[9]胡捷，防止皮蛋沙门氏菌食物中毒的快速检验研究，肉品卫生，1997，7(7)：1-4
[11]蔡学忠等，沙门氏菌鞭毛相变的分子遗传学机制研究进展遗传，1995：70-80。
[12]Saeed. A. M.The impact of Salmonella enteritidis on public health and environmental quality, United States Animal Health Association 1998: 541-554.
[13]杜元钊，沙门氏菌的研究情况报告 内部资料
[14]张碧波等，应用噬菌体快速检测沙门氏菌 动物检疫，1994，11：1-2．
[15]Cloak. O.M, et al, Development of a surface adhesion immunofluorescent technique for the rapid detection of Salmonella. spp. from meat and poultry. Journal of Applied Micrpbiology. 1999.4. 583-590.
[16]Ploner M. Development of piezoelectric immunosensor for detection of entrrobacteria Enzymol Micro Technol, 1992, 14(3):2340
[17] Fitts R. DNA-DN hybridization assay for detection of Salmonella spp. in foods, Appli Microbiol 1983,46:1146-1151.
[18] Prusak-Sochaczewski E, luong JHT and Guilault GG, Development of a piezoelectric immunosersor for the detection of Salmonella typhimurium, Enzymol Micro Technol, 1990. 12:173.
[19] Soumet C, et al. Identification by a multiplex PCR-based assay of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis strains from enviromental swabs of poultry houses. Letters in Applied Miorobiology (1999) 29 (1) 1-6.
[20] 文其乙：沙门氏菌的基因分型和指纹图谱分析及其在分子流行病学中的应用中国畜禽传染病，1994．6：57—59．
[21] 苏世彦．食品微物物检验手册．中国轻工业出版社．1998：20
[22] Krysinki E.P. et al. Use of enzyme-labelled antibodies to detect Salmonella in food. Appl. Envoiron. Microbiol. 1977.33.947.
[23] Swaminathan B. Enzyme immunoassays for salmonella: Onesday testing is now a reality. Food. Tech. 1980.39.93-89.
[24] Robinson, BJ. Enzyme immuno, assay in which a myeloma protein is used for detection of salmonella. Appli Envion Microbiol. 1983.45. 1816-1821.
[25] Anderson JM, Direct immunoassay for detection of Samonella in foods and feeds. Appli Enviroml Microbio 1985:49.1124-1127.
[26] Mattingly J.A. An enzyme immunoassay for the detection of all Salmonella using a combination of a myeloma protein and a hybridoma antibody. J. of Immunol. Methods. 1984,73:147-156.
[27] 马彬等，用ELISA双抗体夹心快速检验肉品污染的沙门氏菌 中国兽医科技，1992，22(5)：21-23。
[28] 周宗清，抗沙门氏菌单抗夹心ELISA试验的建立与应用于 上海农业学报刊1992，8，57-64
[29]王志亮等，沙门氏菌属特异性单克隆抗体检测试剂的研制及初步鉴定，江苏农学院学报，1993，14(2)69-73
[30]文其乙，应用直接ELISA检测肉品中的沙门氏菌，肉品卫生，1994，9：1-3．
[31]文其乙 应用直接ELISA检测蛋品中的沙门氏菌 中国卫生检验杂志 1996，6：358-359．
[32]文其乙 应用直接ELISA检测鲜奶中的沙门氏菌 中国人兽共患病杂志1995，11(6)：41—42．
[33]顾炳泉，用单抗ELISA快速检验鱼粉沙门氏菌 中国兽医杂志 2000，26(6)：54
[34]郑明光，动物性食品卫生学 吉林科学技出版社 1999，17—22。
[35]陈士恩等，细菌内毒素(脂多糖)化学结构研究的某些进展 动物毒物学1989，4(1)：35—5．
[36]钟启平等，酶解凝胶色谱法制备志贺氏菌脂多糖，微生物学通报，1997，24(5)：313-314．
[37]焦新安等，沙门氏菌单克隆抗体应用研究的进展 单克隆抗体通讯1990 b(4)：62-66．
[38]张如宽等，抗沙门氏菌O_4、O_(12)抗原特异单克隆抗体的产生及其特性鉴定江苏农学院学报，1988，9(1)：1—4．
[39]杜元钊等，抗沙门氏菌H_s、Hb、Hd单抗的研制 江苏农学院学报 1989，10(3)：26．
[40]蔡玲民等，沙门氏菌单克隆抗体研究 杂交瘤细胞系的建立2单克隆抗体通迅1990，6(2)：22-30．
[41]S. Tan, et. al Comparison of an LPS-specific competitive ELISA with a motility enrichment cuiture method(MSRV) for detection of Salmonella typhimurium and S. enteritidis in chickens, Veterinary Microbiology 1997(56): 79-86
[42]张艳红等，沙门氏菌快速检测方法研究进展 动物医学进展 2001：2．39-41
[43]Zamora, B.M Detection of antibodies to S. [Salmonella]enteritidis in broilers by means of indirect ELISA and Chemical luminescent immunology assay (CLIA).Journal Veterinary. Medical Series B, 1999. 46(1):229--238.
immunology assay (CLIA).Journal Veterinary. Medical Series B, 1999. 46(1):229--238.
[44]ouglas, D.C. et al , Infect. Immunol 1982, 36 (2): 764-763.
[45]焦新安等，沙门氏菌单克隆抗体检测试剂的研制与应用 中国兽医科技工 1991，21(12)：48-50．
[46]张艳红等，肠炎沙门氏菌脂多糖的提取与制备 动物医学进展 200：3．
[47]李肇增等，鸡白痢菌脂多糖的提取与制备 内蒙古畜牧科学，1997，2：36-38．
[48]黄伟坤主编 食品检验与分析 北京 中国轻工业出版社 1995：32．
[49]Pak-Leong Lim et. al, Diagnosis of enteric fever by inhibition assay using peroxides-labeled monoclonal antibody and salmonella typhi lipoplysaccharide. Aust. J. EXP. Med Sci; 61(6):687--704.
[50]文其乙 沙门氏菌快速检测试剂盒的研制及对样品中的沙门氏菌污染的监测 硕士论文 1995．
[51]陈宝钦 进口动物产品沙门氏菌检验报告 中国进出境动植检1994，3：27-29
[52]J.V. Hassan. etal. Antibody response to experimented Salmonella typhimuriu infection in chickens measured by ELASA. The Veterinary Record, May 26, 1990 519-522.
[53]焦新安等，应用单克隆抗体检测伤寒抗体的研究 中华医学检验杂志1990，13(6)：344-348．