盾叶薯蓣三倍体和二倍体试管苗生物学性状比较
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摘要
盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C．H．Wright）又称黄姜，是我国特有的甾体激素类药源植物。在湖北、陕西、河南、湖南等地区均有较大规模的种植。但由于人们过度采挖，使我国盾叶薯蓣野生资源已面临枯竭。人工栽培成为盾叶薯蓣来源的一种主要方法，但会出现种质衰退严重、薯蓣皂甙元含量低等问题。利用多倍体植物具有生长量较高和抗逆性增强等特点，结合组织培养技术，可为培育高产、优质、高抗的盾叶薯蓣优良种质奠定基础。本研究室利用组织培养技术，通过胚乳培养获得了盾叶薯蓣三倍体植株。在此基础上，本试验研究的是盾叶薯蓣二倍体和三倍体试管苗的快繁、脱分化、薯蓣皂甙元含量以及不同光照强度下的抗性表现差异等，以评价二倍体和三倍体试管苗生长时期的特性，为研究开发新品种提供理论依据。
主要研究结果如下：
1.筛选出适宜的试管苗快繁培养基。二倍体与三倍体试管苗的适宜快繁培养基分别为MS+6-BA2.0mg·L~-1+NAA0.2mg·L~-1和MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.1mg·L~-1，繁殖周期均为30天，繁殖系数分别达到为5.62和4.50，株高分别为5.32cm和4.07cm。
2.筛选出适宜的试管苗生根培养基。二倍体与三倍体试管苗的适宜生根培养基分别为1/2MS+IBA0.3mg·L~-1+Ce(NO3)35mg·L~-1和1/2MS+NAA0.3mg·L~-1+Ce_(NO_3)_310mg·L~-1，生根周期均为45天，生根率分别为98.75%和93.65%，根数分别为16.10条和18.50条。
3.对二倍体和三倍体愈伤组织的诱导、生长量及可溶性糖和可溶性蛋白含量进行了研究。发现不论是二倍体还是三倍体，均为茎段的诱导效果优于叶片的诱导效果；不论是以茎段还是叶片为外植体，二倍体比三倍体更容易诱导形成愈伤组织。二倍体和三倍体茎段愈伤组织的最佳诱导培养基相同，均为MS+2,4-D1.5mg·L~-1+6-BA1.0mg·L~-1，诱导率分别达到100.00%和80.00%；叶片愈伤组织的最佳诱导培养基分别为MS+2,4-D1.0mg·L~-1+6-BA0.5mg·L~-1和MS+2,4-D1.5mg·L~-1+6-BA0.5mg·L~-1，诱导率分别为93.75%和56.25%。愈伤组织的生长曲线均呈“S”型，二倍体愈伤组织较三倍体愈伤组织增长速度快，且延迟期和指数生长期早3天。在各自的生长周期内，可溶性糖含量均呈现出“双峰型”，可溶性蛋白含量均呈现出“单峰型”。
4.对二倍体和三倍体茎段、叶片和愈伤组织中薯蓣皂甙元含量进行了测定。结果显示，二倍体和三倍体叶片分别为2.876%和4.073%，增幅为41.61%；二倍体和三倍体茎段分别为0和1.496%；二倍体和三倍体愈伤组织分别为0.679%和1.676%，增幅达146.91%。
5.对不同光照强度下二倍体和三倍体试管苗的部分生理生化指标进行了测定。（1）随光照强度（750lx、2000lx和3200lx）的增加，可溶性糖和可溶性蛋白含量、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总含量均呈现先增加后减少的趋势，并在光照强度为2000lx时达到最大值，且在各处理中，三倍体试管苗中的上述各指标含量始终高于二倍体试管苗；（2）随着光照强度的增加，O－2·含量、MDA含量和相对电导率出现先减少后增加的趋势，在光照强度为2000lx时，出现最低值，且各处理三倍体试管苗的O2·－含量、MDA含量和相对电导率均低于二倍体试管苗；（3）随光照强度的增加，SOD和POD活性均呈现先增加再减少的趋势，均在光照强度为2000lx时达到最大值，且各处理中三倍体试管苗叶片的SOD和POD活性均高于二倍体试管苗。结果表明，三倍体试管苗较二倍体试管苗抗逆性更强。
Dioscorea zingiberensis C.H.Wright，known as yellow ginger, is an important source plant for steroidhormone medicines. It is largely planted in Hubei, Shanxi, Henan, Hunan and other regions. The resourceof wild D.zingiberensis is being in exhaustion due to over-harvest in the past years and thus plantingbecomes the main source of this medicinal plant. However, some problems are present during planting suchas serious degeneration of quantity and decline of diosgenin content. Polyploid plants have some goodcharacteristics such as high production, high resistance to various diseases, etc. and thus can be aconsideration for breeding variety of Dioscorea zingiberensis with high yield, good quality and highresistance combined with tissue culture technology. In our previous study, triploid plantlets were obtainedby using endosperm cultivation technology. In this study, rapid propagation, dedifferention, diosgenincontent and resistance to diseases under different light intensity were compared between diploid andtriploid plantlets to evaluate their growth characteristics and provide theoretical basis for development ofnew varieties.
The following main results were obtained:
1. The suitable medium for plantlet rapid propagation were obtained by screening. The medium fordiploid and triploid plantlets was MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1and MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1, respectively. Both reproductive cycles were30d and the propagation coefficient was5.50and4.50,respectively.
2. The suitable medium for plantlet rooting was selected. Rooting culture medium suitable for diploidand triploid plantlets was1/2MS+IBA0.3mg·L-1+Ce(NO13)35mg·L-and1/2MS+NAA0.3mg·L-1+Ce(NO3)310mg·L-1, respectively. Both rooting cycle were45d. Rrooting rate for diploid and triploidplantlets was98.75%and93.65%, and the root number was16.10and18.50, respectively.
3. Callus induction, growth characteristics, soluble sugar and protein contents were investigated indiploid and triploid plantlets. The results indicated that the induction effects in stem were better than in leaffor both diploid and triploid; however, whether stems or leaves as explant, callus was easier to be inducedin diploid plantes than in triploid plantlets. The best media for diploid and triploid stems callus induction were same: MS+2,4-D1.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1and induction rate was100%and80%, respectively;The best leaf callus induction medium for diploid and triploid was MS+2,4-D1.0mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1and MS+2,4-D1.5mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1, and the induction rate was93.75%and56.25%, respectively.Both growth curves of diploid and triploid callus showed "S" types in which diploid callus grew faster thantriploid callus with3days earlier of delay period and the exponential growth phase. In their growth periods,soluble sugar contents showed double peaks and soluble protein contents showed a single peak.
4. Diosgenin contents in stems, leaves and callus in diploid and triploid plantlets were determined. Theresults indicated that diosgenin contents in leaves in diploid and triploid plantlets were2.876%and4.073%, respectively with an increase amplitude of41.61%in triploid plantlets; Diosgenin contents in stems indiploid and triploid plantlets were0and1.496%, respectively; Diosgenin contents in callus in diploid andtriploid plantlets were0.679%and1.676%, respectively, with an increase amplitude of146.91%intriploid plantlets.
5. Some physiological and biochemical indexes of diploid and triploid plantlets were determinedunder different light intensity (750lx,2000lx and3200lx).(1) Soluble sugar and protein contents,chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid and chlorophyll content were highest at the light intensity of2000lx t. and were always higher in triploid plantlets than in diploid plantlets under each treatment;(2) Thecontents of O2·－, MDA and relative conductivity were lowest under the light intensity of2000lx, the valuesin triploid plantlets were lower than iin diploid plantlets in the above treatment;(3) SOD and PODactivities were highest under2000lx light intensity with higher values in triploid plantlets leaves, whichsuggested that triploid plantlets might have stronger resistance than diploid plantlets.
主要研究结果如下：
1.筛选出适宜的试管苗快繁培养基。二倍体与三倍体试管苗的适宜快繁培养基分别为MS+6-BA2.0mg·L~-1+NAA0.2mg·L~-1和MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.1mg·L~-1，繁殖周期均为30天，繁殖系数分别达到为5.62和4.50，株高分别为5.32cm和4.07cm。
2.筛选出适宜的试管苗生根培养基。二倍体与三倍体试管苗的适宜生根培养基分别为1/2MS+IBA0.3mg·L~-1+Ce(NO3)35mg·L~-1和1/2MS+NAA0.3mg·L~-1+Ce_(NO_3)_310mg·L~-1，生根周期均为45天，生根率分别为98.75%和93.65%，根数分别为16.10条和18.50条。
3.对二倍体和三倍体愈伤组织的诱导、生长量及可溶性糖和可溶性蛋白含量进行了研究。发现不论是二倍体还是三倍体，均为茎段的诱导效果优于叶片的诱导效果；不论是以茎段还是叶片为外植体，二倍体比三倍体更容易诱导形成愈伤组织。二倍体和三倍体茎段愈伤组织的最佳诱导培养基相同，均为MS+2,4-D1.5mg·L~-1+6-BA1.0mg·L~-1，诱导率分别达到100.00%和80.00%；叶片愈伤组织的最佳诱导培养基分别为MS+2,4-D1.0mg·L~-1+6-BA0.5mg·L~-1和MS+2,4-D1.5mg·L~-1+6-BA0.5mg·L~-1，诱导率分别为93.75%和56.25%。愈伤组织的生长曲线均呈“S”型，二倍体愈伤组织较三倍体愈伤组织增长速度快，且延迟期和指数生长期早3天。在各自的生长周期内，可溶性糖含量均呈现出“双峰型”，可溶性蛋白含量均呈现出“单峰型”。
4.对二倍体和三倍体茎段、叶片和愈伤组织中薯蓣皂甙元含量进行了测定。结果显示，二倍体和三倍体叶片分别为2.876%和4.073%，增幅为41.61%；二倍体和三倍体茎段分别为0和1.496%；二倍体和三倍体愈伤组织分别为0.679%和1.676%，增幅达146.91%。
5.对不同光照强度下二倍体和三倍体试管苗的部分生理生化指标进行了测定。（1）随光照强度（750lx、2000lx和3200lx）的增加，可溶性糖和可溶性蛋白含量、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总含量均呈现先增加后减少的趋势，并在光照强度为2000lx时达到最大值，且在各处理中，三倍体试管苗中的上述各指标含量始终高于二倍体试管苗；（2）随着光照强度的增加，O－2·含量、MDA含量和相对电导率出现先减少后增加的趋势，在光照强度为2000lx时，出现最低值，且各处理三倍体试管苗的O2·－含量、MDA含量和相对电导率均低于二倍体试管苗；（3）随光照强度的增加，SOD和POD活性均呈现先增加再减少的趋势，均在光照强度为2000lx时达到最大值，且各处理中三倍体试管苗叶片的SOD和POD活性均高于二倍体试管苗。结果表明，三倍体试管苗较二倍体试管苗抗逆性更强。
Dioscorea zingiberensis C.H.Wright，known as yellow ginger, is an important source plant for steroidhormone medicines. It is largely planted in Hubei, Shanxi, Henan, Hunan and other regions. The resourceof wild D.zingiberensis is being in exhaustion due to over-harvest in the past years and thus plantingbecomes the main source of this medicinal plant. However, some problems are present during planting suchas serious degeneration of quantity and decline of diosgenin content. Polyploid plants have some goodcharacteristics such as high production, high resistance to various diseases, etc. and thus can be aconsideration for breeding variety of Dioscorea zingiberensis with high yield, good quality and highresistance combined with tissue culture technology. In our previous study, triploid plantlets were obtainedby using endosperm cultivation technology. In this study, rapid propagation, dedifferention, diosgenincontent and resistance to diseases under different light intensity were compared between diploid andtriploid plantlets to evaluate their growth characteristics and provide theoretical basis for development ofnew varieties.
The following main results were obtained:
1. The suitable medium for plantlet rapid propagation were obtained by screening. The medium fordiploid and triploid plantlets was MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1and MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1, respectively. Both reproductive cycles were30d and the propagation coefficient was5.50and4.50,respectively.
2. The suitable medium for plantlet rooting was selected. Rooting culture medium suitable for diploidand triploid plantlets was1/2MS+IBA0.3mg·L-1+Ce(NO13)35mg·L-and1/2MS+NAA0.3mg·L-1+Ce(NO3)310mg·L-1, respectively. Both rooting cycle were45d. Rrooting rate for diploid and triploidplantlets was98.75%and93.65%, and the root number was16.10and18.50, respectively.
3. Callus induction, growth characteristics, soluble sugar and protein contents were investigated indiploid and triploid plantlets. The results indicated that the induction effects in stem were better than in leaffor both diploid and triploid; however, whether stems or leaves as explant, callus was easier to be inducedin diploid plantes than in triploid plantlets. The best media for diploid and triploid stems callus induction were same: MS+2,4-D1.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1and induction rate was100%and80%, respectively;The best leaf callus induction medium for diploid and triploid was MS+2,4-D1.0mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1and MS+2,4-D1.5mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1, and the induction rate was93.75%and56.25%, respectively.Both growth curves of diploid and triploid callus showed "S" types in which diploid callus grew faster thantriploid callus with3days earlier of delay period and the exponential growth phase. In their growth periods,soluble sugar contents showed double peaks and soluble protein contents showed a single peak.
4. Diosgenin contents in stems, leaves and callus in diploid and triploid plantlets were determined. Theresults indicated that diosgenin contents in leaves in diploid and triploid plantlets were2.876%and4.073%, respectively with an increase amplitude of41.61%in triploid plantlets; Diosgenin contents in stems indiploid and triploid plantlets were0and1.496%, respectively; Diosgenin contents in callus in diploid andtriploid plantlets were0.679%and1.676%, respectively, with an increase amplitude of146.91%intriploid plantlets.
5. Some physiological and biochemical indexes of diploid and triploid plantlets were determinedunder different light intensity (750lx,2000lx and3200lx).(1) Soluble sugar and protein contents,chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid and chlorophyll content were highest at the light intensity of2000lx t. and were always higher in triploid plantlets than in diploid plantlets under each treatment;(2) Thecontents of O2·－, MDA and relative conductivity were lowest under the light intensity of2000lx, the valuesin triploid plantlets were lower than iin diploid plantlets in the above treatment;(3) SOD and PODactivities were highest under2000lx light intensity with higher values in triploid plantlets leaves, whichsuggested that triploid plantlets might have stronger resistance than diploid plantlets.
引文
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