角膜不同保存方法与术后排斥反应相关性的实验研究
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摘要
本研究通过对不同保存时间的角膜进行移植来探讨角膜排斥反应的发生率，并分析其原因，为提高角膜的透明率、减少排斥反应的发生探索新途径。
材料与方法
1、实验动物：SD大鼠30只，WISTAR大鼠45只，月龄2月，体重180-200克，均为雌性。均购于中国医科大学动物实验中心。
2、角膜保存方法及时间：(1)湿房保存：摘取鼠眼后置4℃冰箱保存48小时。(2)中期保存：取眼球后，抽空房水，注入C_3F_8惰性气体，以肾胺及低分右旋糖酐各半、调整PH值到7.4、加庆大霉素1000u／ml制成湿房保存液，4℃冰箱保存全眼球5天。(3)长期保存：将全眼球置纯甘油中后放入4℃冰箱24小时，然后转移到-20℃冰箱保存3周。
3、动物分组：(1)试验组：取SD大鼠15只双眼角膜用
吉林大学硕士学位论文
不同方法保存后移植到30只W工STAR大鼠右眼，随机分为3
组。I组:异体湿房保存组;H组:异体中期保存组;m组:
异体长期保存组。(2)对照组:SD大鼠与W工STAR大鼠各巧
只。每组5只WIStar大鼠和5只SD大鼠作为3个试验组的
对照组，分别取其左眼用不同方法保存后移植到自体的右眼
上。W组:自体湿房保存组;V组:自体中期保存组;VI组:
自体长期保存组。
4、角膜移植方法:
(1)术前准备:动物适应性饲养7天。动物称重，用1%戊
巴比妥(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，美多丽散瞳，共点眼三
次，用l%利多卡因0.2ml结膜下浸润麻醉。
(2)手术在严格无菌条件下进行，术眼均为右眼，5/0尼
龙线固定上、下直肌，3.75Inln直径环钻在保存角膜钻切作成
植片，植于植床直径为3.Sllun的受体角膜上，10/0尼龙线间
断缝合8针，结膜下注射庆大霉素1万单位，190阿托品眼膏涂
眼，眼睑缝合。自体移植者取其保存的左眼角膜植于右眼，手
术方法相同。术后庆大霉素2万单位每日腹腔注射，连续注射
5天。
吉林人学硕士学位论文
5、临床观察:术后第3日开始每日乙醚麻醉后裂隙灯下
观察，直到出现排斥反应为止。按照Hol 1 and〔31等建立的临床
观察评分标准，以角膜混浊、水肿、新生血管3项之和为角膜
移植排斥反应指数(RejeCtion Index，Rl)。每日记录Rl，
当R工)6时为排斥反应已经发生。
6、病理检查:试验组排斥反应发生后既取出其全眼球，
对照组则在其试验组最后一只大鼠出现排斥后亦全部取出其
全眼球。置10%福尔马林溶液中固定10天后常规石蜡包埋、
冰冻切片、HE染色，01ymPus显微镜下观察摄像。
7、数据处理及统计分析:对异体角膜移植术后观察所得
不同时间及RI值采用配对设计资料t检验方法进行统计分析。
结果
一、角膜移植术后植片情况
在60例大鼠角膜移植术后，48例用于对比研究，其余12
例因各种原因而排除，其中因麻醉术后死亡8例(全部是
Wistar大鼠，试验组3例，对照组5例);中期保存失败1例
(对照组SD大鼠);术后角膜溃疡1例;因角膜暴露、上皮干
燥，植片混浊，前房窥不清1例(W istar大鼠);前房积血1
例。
吉林大学硕士学位论文
裂隙灯观察结果:见表1。
表1术后各组取材时角膜植片的情况
例俐莫歇朔汾翩劳恻中昭于新生血管娜于
数o
9
7l
8
2 34
0
2 3 4 0 1 2 34
1一组别
2 25
平均
肛
7 .33
34
2 23
2 32
52
VI
2、
35
2 6 1 33
2 41
52
35
2 24
6 .28
7 .13
43
52
2 .88
2 .13
11 m IVV
44
2 .43
试验组角膜移植片存活时间:见表2。
表2不同保存时间角膜植片存活时间
组别莎擞平均存活时间(x士s，d)T值P值
I组9 8.11士0.93 tlZ=9.10(0.001
11组7 12.57士0.98 t23二6.23(0.001
111组8 9.63士0.74 tl3=3.71(0.005
注:t12是I组与11组比较，t23是11组与111组比较，tl3是I组与111组比较
二、病理学检查:见表3。
表3各组病理切片情况
组例植床植片
琳巴细胞新生血管淋巴细胞新生血管
别数一耳干++一十十++一+十++-一+石平-
1 9 9 9 4 5 45
11 7 7 7 6 1 61
111 8 8 8 5 3 53
IV 7 77
V 7 77
Vl 8 88
吉林大学硕卜学位论文
讨论
一、角膜排斥反应情况的对比分析:
1、角膜移植术后排斥反应是角膜移植失败最常见的原因，
约占33%一347014一6，，甚至高达60%以上〔7〕。本研究发现，在同种
异体角膜移植术中，从平均RI的结果可以看出:111组术后
(Rl=7.13)优于I组(Rl=7.23)，11组术后(Rl=6.88)又优
于nl组。I组术后植片平均存活时间为8.n士0.93天，出现
排斥反应的时间较早，而且发展快、反应重。H组术后植片平
均存活时间为12.57士0.98天，出现排斥反应的时间较晚，而
且发展慢、反应较轻，与Ardj。mand一N等〔9，’。〕结果显示的HLA一DR
抗原的丧失主要与保存时间有关的结果相一致，H组排斥反应
出现较晚，还可能与对缺氧的耐受性增强有关。m组术后植片
平均存活时间为9.63士0.74天，术后排斥反应出现的时间较
I组有所延长，其保存的角膜材料上皮糜烂易脱落，m组术后
出现排斥反应的时间早晚、快慢及轻重程度均界于I组和H组
之间。各试验
An experimental study on the correlation of penetrating
keratoplasty reject and the time of the donor corneas using
different preserved methods
Shi Jian Jiang , Gu Shu Yan , Department of Ophthalmology , Affiliated third hospitol, JiLin University, ChangChun, 130021
Abstrsct Objection To understand the relations between the penetrating keratoplasty reject and the time of preserved corneal. Methods The rat models of penetrating keratoplasty reject with 30 WISTAR rat and 15 SD rat were randomly into 3 groups, The donor SD rat's corneas preserved different methods were used respectively in the three groups. The others 15 WISTAR rat and 15 SD rat were randomly divided into 3 control groups. The penetrating keratoplasty rejection index(RI) in postoperation, means survival time(MST) of corneal grafts and histopathological changes were inspected. Results The MST was 8.11?.93d in short-term-preserved group, 12.57?
0.98d in medium-term-preserved group and 9.63?.747d in long-term-preserved group. The MST in medium-term-preserved group was prolonged evidently, It showed a significant correlation among three groups (p<0.01 ) . Conclusion The rate of penetrating keratoplasty rejection of postoperative was decreased and rejection time was delayed in medium- term-preserved corneal.
材料与方法
1、实验动物：SD大鼠30只，WISTAR大鼠45只，月龄2月，体重180-200克，均为雌性。均购于中国医科大学动物实验中心。
2、角膜保存方法及时间：(1)湿房保存：摘取鼠眼后置4℃冰箱保存48小时。(2)中期保存：取眼球后，抽空房水，注入C_3F_8惰性气体，以肾胺及低分右旋糖酐各半、调整PH值到7.4、加庆大霉素1000u／ml制成湿房保存液，4℃冰箱保存全眼球5天。(3)长期保存：将全眼球置纯甘油中后放入4℃冰箱24小时，然后转移到-20℃冰箱保存3周。
3、动物分组：(1)试验组：取SD大鼠15只双眼角膜用
吉林大学硕士学位论文
不同方法保存后移植到30只W工STAR大鼠右眼，随机分为3
组。I组:异体湿房保存组;H组:异体中期保存组;m组:
异体长期保存组。(2)对照组:SD大鼠与W工STAR大鼠各巧
只。每组5只WIStar大鼠和5只SD大鼠作为3个试验组的
对照组，分别取其左眼用不同方法保存后移植到自体的右眼
上。W组:自体湿房保存组;V组:自体中期保存组;VI组:
自体长期保存组。
4、角膜移植方法:
(1)术前准备:动物适应性饲养7天。动物称重，用1%戊
巴比妥(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，美多丽散瞳，共点眼三
次，用l%利多卡因0.2ml结膜下浸润麻醉。
(2)手术在严格无菌条件下进行，术眼均为右眼，5/0尼
龙线固定上、下直肌，3.75Inln直径环钻在保存角膜钻切作成
植片，植于植床直径为3.Sllun的受体角膜上，10/0尼龙线间
断缝合8针，结膜下注射庆大霉素1万单位，190阿托品眼膏涂
眼，眼睑缝合。自体移植者取其保存的左眼角膜植于右眼，手
术方法相同。术后庆大霉素2万单位每日腹腔注射，连续注射
5天。
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5、临床观察:术后第3日开始每日乙醚麻醉后裂隙灯下
观察，直到出现排斥反应为止。按照Hol 1 and〔31等建立的临床
观察评分标准，以角膜混浊、水肿、新生血管3项之和为角膜
移植排斥反应指数(RejeCtion Index，Rl)。每日记录Rl，
当R工)6时为排斥反应已经发生。
6、病理检查:试验组排斥反应发生后既取出其全眼球，
对照组则在其试验组最后一只大鼠出现排斥后亦全部取出其
全眼球。置10%福尔马林溶液中固定10天后常规石蜡包埋、
冰冻切片、HE染色，01ymPus显微镜下观察摄像。
7、数据处理及统计分析:对异体角膜移植术后观察所得
不同时间及RI值采用配对设计资料t检验方法进行统计分析。
结果
一、角膜移植术后植片情况
在60例大鼠角膜移植术后，48例用于对比研究，其余12
例因各种原因而排除，其中因麻醉术后死亡8例(全部是
Wistar大鼠，试验组3例，对照组5例);中期保存失败1例
(对照组SD大鼠);术后角膜溃疡1例;因角膜暴露、上皮干
燥，植片混浊，前房窥不清1例(W istar大鼠);前房积血1
例。
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裂隙灯观察结果:见表1。
表1术后各组取材时角膜植片的情况
例俐莫歇朔汾翩劳恻中昭于新生血管娜于
数o
9
7l
8
2 34
0
2 3 4 0 1 2 34
1一组别
2 25
平均
肛
7 .33
34
2 23
2 32
52
VI
2、
35
2 6 1 33
2 41
52
35
2 24
6 .28
7 .13
43
52
2 .88
2 .13
11 m IVV
44
2 .43
试验组角膜移植片存活时间:见表2。
表2不同保存时间角膜植片存活时间
组别莎擞平均存活时间(x士s，d)T值P值
I组9 8.11士0.93 tlZ=9.10(0.001
11组7 12.57士0.98 t23二6.23(0.001
111组8 9.63士0.74 tl3=3.71(0.005
注:t12是I组与11组比较，t23是11组与111组比较，tl3是I组与111组比较
二、病理学检查:见表3。
表3各组病理切片情况
组例植床植片
琳巴细胞新生血管淋巴细胞新生血管
别数一耳干++一十十++一+十++-一+石平-
1 9 9 9 4 5 45
11 7 7 7 6 1 61
111 8 8 8 5 3 53
IV 7 77
V 7 77
Vl 8 88
吉林大学硕卜学位论文
讨论
一、角膜排斥反应情况的对比分析:
1、角膜移植术后排斥反应是角膜移植失败最常见的原因，
约占33%一347014一6，，甚至高达60%以上〔7〕。本研究发现，在同种
异体角膜移植术中，从平均RI的结果可以看出:111组术后
(Rl=7.13)优于I组(Rl=7.23)，11组术后(Rl=6.88)又优
于nl组。I组术后植片平均存活时间为8.n士0.93天，出现
排斥反应的时间较早，而且发展快、反应重。H组术后植片平
均存活时间为12.57士0.98天，出现排斥反应的时间较晚，而
且发展慢、反应较轻，与Ardj。mand一N等〔9，’。〕结果显示的HLA一DR
抗原的丧失主要与保存时间有关的结果相一致，H组排斥反应
出现较晚，还可能与对缺氧的耐受性增强有关。m组术后植片
平均存活时间为9.63士0.74天，术后排斥反应出现的时间较
I组有所延长，其保存的角膜材料上皮糜烂易脱落，m组术后
出现排斥反应的时间早晚、快慢及轻重程度均界于I组和H组
之间。各试验
An experimental study on the correlation of penetrating
keratoplasty reject and the time of the donor corneas using
different preserved methods
Shi Jian Jiang , Gu Shu Yan , Department of Ophthalmology , Affiliated third hospitol, JiLin University, ChangChun, 130021
Abstrsct Objection To understand the relations between the penetrating keratoplasty reject and the time of preserved corneal. Methods The rat models of penetrating keratoplasty reject with 30 WISTAR rat and 15 SD rat were randomly into 3 groups, The donor SD rat's corneas preserved different methods were used respectively in the three groups. The others 15 WISTAR rat and 15 SD rat were randomly divided into 3 control groups. The penetrating keratoplasty rejection index(RI) in postoperation, means survival time(MST) of corneal grafts and histopathological changes were inspected. Results The MST was 8.11?.93d in short-term-preserved group, 12.57?
0.98d in medium-term-preserved group and 9.63?.747d in long-term-preserved group. The MST in medium-term-preserved group was prolonged evidently, It showed a significant correlation among three groups (p<0.01 ) . Conclusion The rate of penetrating keratoplasty rejection of postoperative was decreased and rejection time was delayed in medium- term-preserved corneal.
引文
1 邱孝芝，金袖云，等．甘油冷冻保存眼球的实验研究与临床应用．实用眼科杂志，1994，12：394-397．
2 谢立信，董晓光，李绍伟，等．甘油冷冻保存角膜用于穿透性角膜移植的初步报告．1999，17：202-205．
3 Blake DA, Roberts DD,Vogel T, et al.Common cryopreservation media deplete cornal endothelial cell plasma membrane Na+,K+ ATase activity.Curr Eye Res,1996,15:263.
4 汤爱菊，彭树道．改良眼球湿房保存法的实验研究及临床应用．中国实用眼科杂志 1995，13(9)：550-552．
5 The Australian Corneal Graft Registry. 1990 to 1992 report. Aust-N-Z-J-Ophthalmol. 1993 May; 21(2 Suppl): 1-48.
6 Williams-KA; Muehlberg-SM; Lewis-RF; Coster-DJ, Eye. 1995; 9 (Pt 2): 219-27.
7 Torres-PF; De-Vos-AF; van-der-Gaag-R; Martins-B; Kijlstra-A, Exp-Eye-Res. 1996 Oct; 63(4): 453-61.
8 Maureen GM,Walter Js,John DG. Ophthalmology 1994;101:1536.
9 Yamagami-S; Isobe-M; Yamagami-H; Hori-J; Tsuru-T, Transplantation. 1997 Jul 15; 64(1): 42-8.
10 Ardjomand-N; Berghold-A; Reich-ME, Eye. 1998; 12 (Pt 1): 134-8.
11 Ardjomand-N; Komericki-P; Radner-H; Aigner-R; Reich-ME, Ophthalmologe. 1997 Oct; 94(10): 703-6.
12 Holland-EJ et al. Arch-Ophthalmol.1987 Apr;105 (4):542-545.
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17 Nguyen-NX et al. Klin-Monatsbl-Augenheilkd. 1999 Sep; 215(3): 169-74.
2 谢立信，董晓光，李绍伟，等．甘油冷冻保存角膜用于穿透性角膜移植的初步报告．1999，17：202-205．
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4 汤爱菊，彭树道．改良眼球湿房保存法的实验研究及临床应用．中国实用眼科杂志 1995，13(9)：550-552．
5 The Australian Corneal Graft Registry. 1990 to 1992 report. Aust-N-Z-J-Ophthalmol. 1993 May; 21(2 Suppl): 1-48.
6 Williams-KA; Muehlberg-SM; Lewis-RF; Coster-DJ, Eye. 1995; 9 (Pt 2): 219-27.
7 Torres-PF; De-Vos-AF; van-der-Gaag-R; Martins-B; Kijlstra-A, Exp-Eye-Res. 1996 Oct; 63(4): 453-61.
8 Maureen GM,Walter Js,John DG. Ophthalmology 1994;101:1536.
9 Yamagami-S; Isobe-M; Yamagami-H; Hori-J; Tsuru-T, Transplantation. 1997 Jul 15; 64(1): 42-8.
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11 Ardjomand-N; Komericki-P; Radner-H; Aigner-R; Reich-ME, Ophthalmologe. 1997 Oct; 94(10): 703-6.
12 Holland-EJ et al. Arch-Ophthalmol.1987 Apr;105 (4):542-545.
13 Gabric-N; Dekaris-I; Suman-L; Karaman-Z; Mravicic-I, Exp-Eye-Res. 1999 Mar; 68(3): 277-82.
14 Sonoda-Y; Sano-Y; Ksander-B; Streilein-JW, Invest-Ophthalmol-Vis-Sci. 1995 Feb; 36(2): 427-34.
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