益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎COXⅠ、COXⅡ，ATP6，RPL27a基因表达的影响
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摘要
实验目的：
病毒性心肌炎(VMC)是由嗜心性病毒感染引起的以心肌细胞变性、坏死和间质炎细胞浸润及纤维渗出为主要改变的心肌疾病，几乎所有的病毒均可引起心肌炎症。其中，以柯萨奇B组病毒3（CVB3）具有强嗜心性。本病发病率有逐年增高的趋势，严重威胁儿童和青壮年健康。因此，对CVB3病毒性心肌炎的治疗机制的研究显得迫在眉睫。随着研究的深入，CVB3感染病毒性心肌炎模型的建立，成为目前主要的研究对象。中医虽无病毒性心肌炎之病名，但从本病的发病特点可归于祖国医学的《温病》范畴，根据临床表现特点又可归属于“心悸”、“虚劳”、“心痛”等范畴。近年来，中医药在病毒性心肌炎的临床治疗中，总结出许多有效的用药经验和治疗方法，其疗效确切、安全可靠，充分显示出中医药VMC机制研究的必要性。
本课题根据中医基本理论，结合了治疗病毒性心肌炎临床实践，探索出以黄芪、白参、丹参、郁金、麦冬、白茅根等中药组成的益气活血中药复方，为治疗本病的有效方剂。通过本研究以揭示中医药治疗病毒性心肌炎的（VMC）的作用机制，并且针对病原和保护心肌两个方面选择指标。以乳鼠心肌细胞体外培养，建立了CVB3心肌细胞感染模型，并利用改良的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization SSH）等分子生物学技术，观察受CVB3攻击的宿主细胞与益气活血中药复方治疗组中cytochrome coxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a基因表达的变化，从基因水平探讨益气活血中药复方调控病毒性心肌炎的作用机制。进一步证实益气活血法是治疗VMC的有效方法，益气活血中药复方是防治本病的有效方药。
实验方法：
1、Hela细胞的复苏及培养：将冻存于液氮中的Hela细胞冻存管取出，迅速放入预先加热的37℃水浴箱中，不断摇动复温约30秒，待冻存液溶解，将细胞悬液迅速移入无菌离心管中，加入3ml含10%胎牛血清DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃上清，再加入15ml含10%FBS的DMEM培养液，用移液器反复吹打制成单细胞悬液后移入新培养瓶中，于37°C，5％二氧化碳100%饱和湿度的CO2孵育箱中培养，人宫颈癌细胞株Hela为贴壁生长细胞，生长于含有10％特级胎牛血清DMEM细胞培养液中，24h细胞即进入对数生长期，约72h细胞就能长满瓶底，当细胞生长至80％～90%融合时，用胰酶/EDTA将贴壁生长的细胞消化传代，整个过程要求在超净工作台中进行，严格无菌操作。
2、益气活血中药复方的细胞毒性测定：将进入对数生长期Hela细胞用胰酶/EDTA消化，台盼蓝染色记录活细胞数（＞95%），细胞计数板计数，调节活细胞浓度为5×105/ml，以每孔0.2ml接种到96孔细胞培养板中，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h，当Hela细胞全部贴壁生长时，测定益气活血中药复方最大无毒剂量。吸弃培养液，加入用DMEM培养液配置的益气活血中药复方注射液0.2ml/孔，共计11个浓度梯度，即原液、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024，设4个复孔，另设4个加正常细胞生长液的对照孔。分别于24h、48h后，于倒置显微镜下观察细胞生长状态，参考正常对照孔细胞形态，以不引起细胞形态改变的最大药物稀释浓度为最大无毒浓度（TD0）。
3、滴定CVB3病毒的毒力：消化后Hela细胞接种于96孔培养板中，待24h后Hela细胞贴壁后，微量移液器吸去培养板中的生长液，每孔以HBSS液分别洗涤2次后，弃去HBSS液。加入含CVB3病毒的DMEM维持液（含2％胎牛血清），CVB3病毒从10倍浓度被稀释到10－1、10－8，每个浓度设4个复孔，另设4个正常对照孔，每孔各加维持液0.1ml，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，分别于24h、48h后观察细胞病变情况，参考正常对照孔细胞形态。
4、MTT法测定益气活血中药复方抑制CVB3致心肌细胞死亡的实验：取对数生长期心肌细胞，使用微量移液器每孔加入0.2ml半数组织感染量浓度CVB3病毒，吸附2h，使心肌细胞感染，吸弃含病毒培养液，加入含2％胎牛血清的维持液3ML，轻轻摇晃培养板洗涤细胞一遍后，依次加入含益气活血中药复方的生长液0.2ml/孔，从药物最大无毒剂量起始稀释8个浓度，每个浓度设4个复孔，另设1个调零孔。于CO2细胞培养箱中培养48h，每孔加入0.18ml DMEM培养液后，再加入0.02ml MTT（0.5%MTT）溶液，放入培养箱继续培养4h，吸弃孔内培养液，再加入0.15ml/孔的DMSO，置振荡器上振荡8-10min，使Formazan结晶溶解，于酶标仪上490nm处测量各孔的吸光值（OD）。
5、观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞细胞色素C氧化酶亚基I、II，ATP6，RP L27a基因表达的影响：通过改良的抑制性消减杂交技术（SSH）测定大鼠细胞CVB3感染组和益气活血中药复方给药组基因表达的差异，并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证。
实验结果：
1、益气活血中药复方细胞毒性测定结果：益气活血中药复方最大无毒浓度（TD0）为1：128稀释浓度，相当于最大无毒剂量为7.813mg/ml；
2、 CVB3病毒的毒力滴定：CVB3病毒使50%培养心肌细胞感染量为1×10-4.5；
3、 MTT法测定益气活血中药复方抑制CVB3致心肌细胞死亡的实验结果：应用不同浓度益气活血中药复方干预CVB3攻击后的心肌细胞，结果发现最大无毒剂量干预CVB3攻击后的心肌细胞的吸光度值（OD值）最大（2.326±0.198），与其它稀释度组相比，统计学差异极为显著（P＜0.001）。证实益气活血中药复方最大无毒剂量可明显抑制CVB3感染心肌细胞的死亡，使心肌细胞存活率最高；
4、观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞cytochrome c oxidase subunitI， cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal proteinL27a基因表达的影响：SSH结果显示益气活血中药复方治疗组中cytochrome c oxidasesubunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a基因的表达水平比CVB3病毒感染组明显增高，并通过荧光RT-PCR检测上述基因的表达水平，实验结果与SSH结果一致。
结论：
1.采用新生大鼠原代心肌细胞体外培养方法,成功建立CVB3攻击的心肌细胞感染模型。
2.通过观察益气活血中药复方可以上调CVB3病毒性心肌炎心肌细胞基因cytochrome c oxidase subunit I， cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthaseF0subunit6，ribosomal protein L27a的表达，证实了具有益气活血功效的中药复方，是通过调节上述基因，来实现治疗病毒性心肌炎的目的。
3.本实验进一步证实了益气活血法是治疗VMC的有效法则，而益气活血中药复方是治疗VMC的有效方剂，提示本方在VMC的治疗中具有广阔的应用前景。
Objects:
Viral myocarditis（VMC）is a kind of myocardial disease with pathology injuryof myocardium degeneration and necrosis, fiberours and infiltration ininflammatory cells. VMC can be induced by almost any virus, especially acardiotropic variant of coxsackievirus group B（CVB3）. Thus the VMC model inducedby CVB3has been mainly researched.
The increasing of incidence of VMC shows serious threat to the health ofchildren and young ages. And studies of treating mechanism of VMC is imperative.
The disease name of VMC is not exist in Traditional Chinese Medicine. InTCM VMC can be categorized as febrile disease according to its incidencecharacteristics, or cardiopalmus, deficiency and exhaustion, heartacheaccording to its clinical symptoms.In recent years of clinical researches of VMC, many effective experiences andtreatments had been concluded in Traditional Chinese Medicine that showedobvious efficacy and safety, and the necessity of studying on TCM treating VMCas well.
Combined with Traditional Chinese medicine theory and clinical practices,Chinese herbal compound with astragalus, white ginseng, salvia, curcuma,liriope etc. was found out to supplementing Qi and activating blood circulation,which was therapeutic In this study.
The indexes of pathogen and myocardial protection chosen in this study revealthe therapeutic mechanism of TCM treating VMC.
After modeling the CVB3induced VMC, the expression of cytochrome c oxidasesubunit I, cytochrome coxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a in host cell of CVB3and Chinese herbal compound Group were observedby suppression subtractive hybridization (SSH). Exploring the regulationtargets and the mechanism on gene level with the Chinese herbal compound ofsupplementing Qi and activating blood circulation.
This study showed that the suppression subtractive hybridization (SSH) isa differential display technique that improved and effective. In Chinese herbalcompound Group, the expression of cytochrome c oxidase subunit I，cytoc hromec oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27a wasincreased, which suggested that the Chinese herbal compound of supplementingQi and activating blood circulation treated VMC by regulating this gene, andembodied the theoretical thought of Strengthening Healthy Qi to EliminatePathogens in TCM.
Methods
1.The recovery and culture of Hela cell: The Hela freezing tube was taken outfrom the cryopreserved in liquid nitrogen, and rapidly removed it into a heatedwater box at37℃, shook it in the heated water box constantly to rewarm forabout30seconds until Hela freezing tube dissolved, put the cell suspensioninto sterile centrifuge tube rapidly, added3ml DMEM medium which containing10%fetal bovine serum,1000rpm centrifugated for5min, discarded thesupernatant, add15ml DMEM culture liquid with10%FBS, blowing the depositioninto single cell suspension with pipette repeatedly before the movement intonew culture flask, then incubated it at37degrees centigrade,5%CO2,100%saturated humidity box. Human cervical carcinoma cell was adherent growth cells,growing in DMEM cell culture medium containing10%fetal bovine serum, cellsentered into logarithmic growth phase after24h, the total bottom of the bottlecould be packed with cells about72h, when cells were grown to80%~90%fusion,digested the adherent cells with pancreatin/EDTA, the process required in theultra-clean table, strict aseptic operation.
2．Cytotoxicity determination of the Chinese herbal compound of supplementingQi and activating blood circulation: Digested the Hela cells which entered thelogarithmic growth phase by pancreatin/EDTA, trypan blue was used to stainand took the record the number of living cells with counting plate (>95%),regulation of living cells at a concentration of5x105/ml, the recovered Hela cells were inoculated in96culture plates with each hole0.2ml，culturedin incubator with37℃，5%CO2. incubator for24h.when Hela cells all adherentgrowth, to test the maximum nontoxic dosage in the Chinese herbal compound ofsupplementing Qi and activating blood circulation while Hela cells displayedmonolayer growth.Prepared the stock solution of the Chinese herbal compound ofsupplementing Qi and activating blood circulation into11concentrations withDMEM. Each concentration with4multiple wells,0.2ml per well, and4controlwells for normal growth medium. The cell morphology was observed at24h and48hreference to the normal control wells. The maximum nontoxic concentration（TD0）was determined to be the maximum diluted concentration that can not inducecytopathogenic effect.
3.Toxicity test of CVB3: After Hela cells displayed monolayer growth in96wellsplates, the growth medium in plates was removed, and the culture wells were washedwith HBSS for2times. The CVB3was diluted from10－1to10－8by decupleconcentration with2%fetal bovine serum maintenance solution, and wasinoculated in96wells plate,0.1ml per well. Each concentration with4multiplewells and4normal control wells, add maintenance solution0.1ml, cultured inincubator with37℃，5%CO2. The cell morphology was observed at24h and48h.
4. Inhibition of the Chinese herbal compound of supplementing Qi and activatingblood circulation on CVB3induced cardiac myocyte death(MTT method): Myocardialcells at logarithmic growth phase were collected, each well was added mediantissue infection concentration TCID50CVB30.2ml to myocardial cells adsorptionfor2h.Removed CVB3contained culture solution, washed once tenderly with2%fetal bovine serum maintenance solution, added growth solution with the Chineseherbal compound of the8th concentration from the initial maximum nontoxic dosage,0.2ml per well. Each concentration with4multiple wells and1zero well. After48h,0.18ml DMEM and0.02ML MTT were added each well, cultured in incubator for4h, removed culture solution carefully, then0.15ml DMSO was added, after8minutes oscillation,490nm OD of each well were tested by enzyme linked immunityinstrument.
5．Effects of the Chinese herbal compound of supplementing Qi andactivating blood circulation on gene expression of cytochrome coxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27a in CVB3induced VMC myocardial cells:Isolation of differentially expressed gene in rat myocardial cells of the CVB3infected group and the Chinese herbal compound group by SSH, and confirmthe results above by real-time RT-PCR.
Results:
3.1Determination of Boosting Qi and Enlivening Blood Formula cytotoxicity: themaximum non-toxic dose for the formula is7.813mg/ml.
3.2CVB3virulence titration: the infection rate of50%cultured CVB3virus cellsis1×10-4.5.
3.3Boosting qi and enlivening blood formula inhibition of myocardial cell deathfrom CVB3virus(MTT method):use of maximum non-toxic dose boosting qi andenlivening blood formula on post-attack myocardial cells， had the largestabsorption value， and in comparison with other dilutions there was a cleardifference， p<0.001. This shows that the maximum non-toxic dose of boostingqi and enlivening blood formula has a clear inhibitory effect on CVB3inducedmyocardial cell death.
3.4Effects of the Chinese herbal compound injection of supplementingQi and activating blood circulation on gene expression of cytochromec oxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthaseF0subunit6，ribosomal protein L27a in CVB3induced VMC myocardialcells: The result of SSH showed that in the Chinese herbal compound groupthe expression of cytochrome c oxidase subunit I， cytochrome coxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27awas higher than the CVB3infected group, which was confirmed by real-timeRT-PCR.
Conclusion:
1. The CVB3induced VMC was successfully modeled by cultured primary myocardialcells.
2. It was confirmed that the Chinese herbal compound of supplementing Qiand activating blood circulation is multifunctional, multileveled andmulti-targeted for CVB3induced VMC by observing its effects onexpression of cytochrome c oxidase subunit I, cytochrome c oxidasesubunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27a.
3. This study further verified that supplementing Qi and activating bloodcirculation is a effective way of treating VMC, and the Chinese herbal compoundof supplementing Qi and activating blood circulation is a curative prescription,which suggested its broad application prospect in treating VMC.
病毒性心肌炎(VMC)是由嗜心性病毒感染引起的以心肌细胞变性、坏死和间质炎细胞浸润及纤维渗出为主要改变的心肌疾病，几乎所有的病毒均可引起心肌炎症。其中，以柯萨奇B组病毒3（CVB3）具有强嗜心性。本病发病率有逐年增高的趋势，严重威胁儿童和青壮年健康。因此，对CVB3病毒性心肌炎的治疗机制的研究显得迫在眉睫。随着研究的深入，CVB3感染病毒性心肌炎模型的建立，成为目前主要的研究对象。中医虽无病毒性心肌炎之病名，但从本病的发病特点可归于祖国医学的《温病》范畴，根据临床表现特点又可归属于“心悸”、“虚劳”、“心痛”等范畴。近年来，中医药在病毒性心肌炎的临床治疗中，总结出许多有效的用药经验和治疗方法，其疗效确切、安全可靠，充分显示出中医药VMC机制研究的必要性。
本课题根据中医基本理论，结合了治疗病毒性心肌炎临床实践，探索出以黄芪、白参、丹参、郁金、麦冬、白茅根等中药组成的益气活血中药复方，为治疗本病的有效方剂。通过本研究以揭示中医药治疗病毒性心肌炎的（VMC）的作用机制，并且针对病原和保护心肌两个方面选择指标。以乳鼠心肌细胞体外培养，建立了CVB3心肌细胞感染模型，并利用改良的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization SSH）等分子生物学技术，观察受CVB3攻击的宿主细胞与益气活血中药复方治疗组中cytochrome coxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a基因表达的变化，从基因水平探讨益气活血中药复方调控病毒性心肌炎的作用机制。进一步证实益气活血法是治疗VMC的有效方法，益气活血中药复方是防治本病的有效方药。
实验方法：
1、Hela细胞的复苏及培养：将冻存于液氮中的Hela细胞冻存管取出，迅速放入预先加热的37℃水浴箱中，不断摇动复温约30秒，待冻存液溶解，将细胞悬液迅速移入无菌离心管中，加入3ml含10%胎牛血清DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃上清，再加入15ml含10%FBS的DMEM培养液，用移液器反复吹打制成单细胞悬液后移入新培养瓶中，于37°C，5％二氧化碳100%饱和湿度的CO2孵育箱中培养，人宫颈癌细胞株Hela为贴壁生长细胞，生长于含有10％特级胎牛血清DMEM细胞培养液中，24h细胞即进入对数生长期，约72h细胞就能长满瓶底，当细胞生长至80％～90%融合时，用胰酶/EDTA将贴壁生长的细胞消化传代，整个过程要求在超净工作台中进行，严格无菌操作。
2、益气活血中药复方的细胞毒性测定：将进入对数生长期Hela细胞用胰酶/EDTA消化，台盼蓝染色记录活细胞数（＞95%），细胞计数板计数，调节活细胞浓度为5×105/ml，以每孔0.2ml接种到96孔细胞培养板中，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h，当Hela细胞全部贴壁生长时，测定益气活血中药复方最大无毒剂量。吸弃培养液，加入用DMEM培养液配置的益气活血中药复方注射液0.2ml/孔，共计11个浓度梯度，即原液、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024，设4个复孔，另设4个加正常细胞生长液的对照孔。分别于24h、48h后，于倒置显微镜下观察细胞生长状态，参考正常对照孔细胞形态，以不引起细胞形态改变的最大药物稀释浓度为最大无毒浓度（TD0）。
3、滴定CVB3病毒的毒力：消化后Hela细胞接种于96孔培养板中，待24h后Hela细胞贴壁后，微量移液器吸去培养板中的生长液，每孔以HBSS液分别洗涤2次后，弃去HBSS液。加入含CVB3病毒的DMEM维持液（含2％胎牛血清），CVB3病毒从10倍浓度被稀释到10－1、10－8，每个浓度设4个复孔，另设4个正常对照孔，每孔各加维持液0.1ml，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，分别于24h、48h后观察细胞病变情况，参考正常对照孔细胞形态。
4、MTT法测定益气活血中药复方抑制CVB3致心肌细胞死亡的实验：取对数生长期心肌细胞，使用微量移液器每孔加入0.2ml半数组织感染量浓度CVB3病毒，吸附2h，使心肌细胞感染，吸弃含病毒培养液，加入含2％胎牛血清的维持液3ML，轻轻摇晃培养板洗涤细胞一遍后，依次加入含益气活血中药复方的生长液0.2ml/孔，从药物最大无毒剂量起始稀释8个浓度，每个浓度设4个复孔，另设1个调零孔。于CO2细胞培养箱中培养48h，每孔加入0.18ml DMEM培养液后，再加入0.02ml MTT（0.5%MTT）溶液，放入培养箱继续培养4h，吸弃孔内培养液，再加入0.15ml/孔的DMSO，置振荡器上振荡8-10min，使Formazan结晶溶解，于酶标仪上490nm处测量各孔的吸光值（OD）。
5、观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞细胞色素C氧化酶亚基I、II，ATP6，RP L27a基因表达的影响：通过改良的抑制性消减杂交技术（SSH）测定大鼠细胞CVB3感染组和益气活血中药复方给药组基因表达的差异，并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证。
实验结果：
1、益气活血中药复方细胞毒性测定结果：益气活血中药复方最大无毒浓度（TD0）为1：128稀释浓度，相当于最大无毒剂量为7.813mg/ml；
2、 CVB3病毒的毒力滴定：CVB3病毒使50%培养心肌细胞感染量为1×10-4.5；
3、 MTT法测定益气活血中药复方抑制CVB3致心肌细胞死亡的实验结果：应用不同浓度益气活血中药复方干预CVB3攻击后的心肌细胞，结果发现最大无毒剂量干预CVB3攻击后的心肌细胞的吸光度值（OD值）最大（2.326±0.198），与其它稀释度组相比，统计学差异极为显著（P＜0.001）。证实益气活血中药复方最大无毒剂量可明显抑制CVB3感染心肌细胞的死亡，使心肌细胞存活率最高；
4、观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞cytochrome c oxidase subunitI， cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal proteinL27a基因表达的影响：SSH结果显示益气活血中药复方治疗组中cytochrome c oxidasesubunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a基因的表达水平比CVB3病毒感染组明显增高，并通过荧光RT-PCR检测上述基因的表达水平，实验结果与SSH结果一致。
结论：
1.采用新生大鼠原代心肌细胞体外培养方法,成功建立CVB3攻击的心肌细胞感染模型。
2.通过观察益气活血中药复方可以上调CVB3病毒性心肌炎心肌细胞基因cytochrome c oxidase subunit I， cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthaseF0subunit6，ribosomal protein L27a的表达，证实了具有益气活血功效的中药复方，是通过调节上述基因，来实现治疗病毒性心肌炎的目的。
3.本实验进一步证实了益气活血法是治疗VMC的有效法则，而益气活血中药复方是治疗VMC的有效方剂，提示本方在VMC的治疗中具有广阔的应用前景。
Objects:
Viral myocarditis（VMC）is a kind of myocardial disease with pathology injuryof myocardium degeneration and necrosis, fiberours and infiltration ininflammatory cells. VMC can be induced by almost any virus, especially acardiotropic variant of coxsackievirus group B（CVB3）. Thus the VMC model inducedby CVB3has been mainly researched.
The increasing of incidence of VMC shows serious threat to the health ofchildren and young ages. And studies of treating mechanism of VMC is imperative.
The disease name of VMC is not exist in Traditional Chinese Medicine. InTCM VMC can be categorized as febrile disease according to its incidencecharacteristics, or cardiopalmus, deficiency and exhaustion, heartacheaccording to its clinical symptoms.In recent years of clinical researches of VMC, many effective experiences andtreatments had been concluded in Traditional Chinese Medicine that showedobvious efficacy and safety, and the necessity of studying on TCM treating VMCas well.
Combined with Traditional Chinese medicine theory and clinical practices,Chinese herbal compound with astragalus, white ginseng, salvia, curcuma,liriope etc. was found out to supplementing Qi and activating blood circulation,which was therapeutic In this study.
The indexes of pathogen and myocardial protection chosen in this study revealthe therapeutic mechanism of TCM treating VMC.
After modeling the CVB3induced VMC, the expression of cytochrome c oxidasesubunit I, cytochrome coxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a in host cell of CVB3and Chinese herbal compound Group were observedby suppression subtractive hybridization (SSH). Exploring the regulationtargets and the mechanism on gene level with the Chinese herbal compound ofsupplementing Qi and activating blood circulation.
This study showed that the suppression subtractive hybridization (SSH) isa differential display technique that improved and effective. In Chinese herbalcompound Group, the expression of cytochrome c oxidase subunit I，cytoc hromec oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27a wasincreased, which suggested that the Chinese herbal compound of supplementingQi and activating blood circulation treated VMC by regulating this gene, andembodied the theoretical thought of Strengthening Healthy Qi to EliminatePathogens in TCM.
Methods
1.The recovery and culture of Hela cell: The Hela freezing tube was taken outfrom the cryopreserved in liquid nitrogen, and rapidly removed it into a heatedwater box at37℃, shook it in the heated water box constantly to rewarm forabout30seconds until Hela freezing tube dissolved, put the cell suspensioninto sterile centrifuge tube rapidly, added3ml DMEM medium which containing10%fetal bovine serum,1000rpm centrifugated for5min, discarded thesupernatant, add15ml DMEM culture liquid with10%FBS, blowing the depositioninto single cell suspension with pipette repeatedly before the movement intonew culture flask, then incubated it at37degrees centigrade,5%CO2,100%saturated humidity box. Human cervical carcinoma cell was adherent growth cells,growing in DMEM cell culture medium containing10%fetal bovine serum, cellsentered into logarithmic growth phase after24h, the total bottom of the bottlecould be packed with cells about72h, when cells were grown to80%~90%fusion,digested the adherent cells with pancreatin/EDTA, the process required in theultra-clean table, strict aseptic operation.
2．Cytotoxicity determination of the Chinese herbal compound of supplementingQi and activating blood circulation: Digested the Hela cells which entered thelogarithmic growth phase by pancreatin/EDTA, trypan blue was used to stainand took the record the number of living cells with counting plate (>95%),regulation of living cells at a concentration of5x105/ml, the recovered Hela cells were inoculated in96culture plates with each hole0.2ml，culturedin incubator with37℃，5%CO2. incubator for24h.when Hela cells all adherentgrowth, to test the maximum nontoxic dosage in the Chinese herbal compound ofsupplementing Qi and activating blood circulation while Hela cells displayedmonolayer growth.Prepared the stock solution of the Chinese herbal compound ofsupplementing Qi and activating blood circulation into11concentrations withDMEM. Each concentration with4multiple wells,0.2ml per well, and4controlwells for normal growth medium. The cell morphology was observed at24h and48hreference to the normal control wells. The maximum nontoxic concentration（TD0）was determined to be the maximum diluted concentration that can not inducecytopathogenic effect.
3.Toxicity test of CVB3: After Hela cells displayed monolayer growth in96wellsplates, the growth medium in plates was removed, and the culture wells were washedwith HBSS for2times. The CVB3was diluted from10－1to10－8by decupleconcentration with2%fetal bovine serum maintenance solution, and wasinoculated in96wells plate,0.1ml per well. Each concentration with4multiplewells and4normal control wells, add maintenance solution0.1ml, cultured inincubator with37℃，5%CO2. The cell morphology was observed at24h and48h.
4. Inhibition of the Chinese herbal compound of supplementing Qi and activatingblood circulation on CVB3induced cardiac myocyte death(MTT method): Myocardialcells at logarithmic growth phase were collected, each well was added mediantissue infection concentration TCID50CVB30.2ml to myocardial cells adsorptionfor2h.Removed CVB3contained culture solution, washed once tenderly with2%fetal bovine serum maintenance solution, added growth solution with the Chineseherbal compound of the8th concentration from the initial maximum nontoxic dosage,0.2ml per well. Each concentration with4multiple wells and1zero well. After48h,0.18ml DMEM and0.02ML MTT were added each well, cultured in incubator for4h, removed culture solution carefully, then0.15ml DMSO was added, after8minutes oscillation,490nm OD of each well were tested by enzyme linked immunityinstrument.
5．Effects of the Chinese herbal compound of supplementing Qi andactivating blood circulation on gene expression of cytochrome coxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27a in CVB3induced VMC myocardial cells:Isolation of differentially expressed gene in rat myocardial cells of the CVB3infected group and the Chinese herbal compound group by SSH, and confirmthe results above by real-time RT-PCR.
Results:
3.1Determination of Boosting Qi and Enlivening Blood Formula cytotoxicity: themaximum non-toxic dose for the formula is7.813mg/ml.
3.2CVB3virulence titration: the infection rate of50%cultured CVB3virus cellsis1×10-4.5.
3.3Boosting qi and enlivening blood formula inhibition of myocardial cell deathfrom CVB3virus(MTT method):use of maximum non-toxic dose boosting qi andenlivening blood formula on post-attack myocardial cells， had the largestabsorption value， and in comparison with other dilutions there was a cleardifference， p<0.001. This shows that the maximum non-toxic dose of boostingqi and enlivening blood formula has a clear inhibitory effect on CVB3inducedmyocardial cell death.
3.4Effects of the Chinese herbal compound injection of supplementingQi and activating blood circulation on gene expression of cytochromec oxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthaseF0subunit6，ribosomal protein L27a in CVB3induced VMC myocardialcells: The result of SSH showed that in the Chinese herbal compound groupthe expression of cytochrome c oxidase subunit I， cytochrome coxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27awas higher than the CVB3infected group, which was confirmed by real-timeRT-PCR.
Conclusion:
1. The CVB3induced VMC was successfully modeled by cultured primary myocardialcells.
2. It was confirmed that the Chinese herbal compound of supplementing Qiand activating blood circulation is multifunctional, multileveled andmulti-targeted for CVB3induced VMC by observing its effects onexpression of cytochrome c oxidase subunit I, cytochrome c oxidasesubunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal protein L27a.
3. This study further verified that supplementing Qi and activating bloodcirculation is a effective way of treating VMC, and the Chinese herbal compoundof supplementing Qi and activating blood circulation is a curative prescription,which suggested its broad application prospect in treating VMC.
引文
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